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A leptospirose é uma zoonose disseminada mundialmente causada por espiroquetas patogênicas do gênero Leptospira [1]. Anualmente, são estimados aproximadamente 1 milhão de casos humanos, embora o número provavelmente seja maior por ser uma doença negligenciada de difícil diagnóstico [2].

Diferentes abordagens tem sido exploradas para o desenvolvimento de uma vacina recombinante de amplo espectro contra leptospirose, a fim de substituir as bacterinas, vacinas atualmente disponíveis para prevenção desta zoonose [3,4]. Esses esforços se justificam pelo fato das bacterinas induzirem imunidade sorovar-específica e de curta duração. Nosso grupo construiu um antígeno quimérico (rQ1), composto pelas proteína LipL32, LemA e LigANI de Leptospira interrogans. Essas proteínas foram escolhidas para construção deste antígeno quimérico por já terem conferido proteção parcial contra leptospirose [5–9], serem conservadas em espécies patogênicas da bactéria e apresentarem porções expostas na superfície externa da célula, facilitando o acesso ao sistema imune.

A quimera construída foi avaliada como vacina de subunidade e BCG recombinante em hamsters, conferindo proteção de 100% contra os sinais clínicos da doença em ambas as estratégias. No entanto, a proteção contra a colonização renal só foi observada nos animais que receberam a vacina vetorizada por BCG [10].

Em termos de mecanismos imunológicos envolvidos na proteção conferida por essas vacinas, apenas a imunidade humoral foi avaliada, assim como na maioria dos trabalhos que utilizam Mesocricetus auratus como modelo animal, devido à falta de insumos para análise de imunidade celular [11,12]. Assim, as análises de resposta imune celular ficam, em maioria, restritas à avaliação dos níveis de expressão de mRNA de citocinas induzidos pelas formulações vacinais [13–16].

Apesar da imunidade humoral já ter sido considerada como prioritariamente envolvida na proteção contra leptospirose, diversos estudos já demonstraram o envolvimento de células Th1 para indução de proteção significativa contra a doença. Sabe-se que a vacina BCG induz, majoritariamente, uma resposta do tipo Th1, e uma imunidade humoral pouco significativa [17,18]. Por outro lado, vacinas de subunidade recombinante estão associadas à indução de níveis significativos de anticorpos, nem sempre correlacionados com proteção [19,20].

Assim sendo, esse projeto tem por objetivo comparar o perfil de expressão de citocinas em hamsters imunizados com o antígeno quimérico apresentado sob a forma de vacina de subunidade e BCG recombinante a fim de caracterizar fatores e mecanismos imunológicos envolvidos na proteção e na indução de imunidade esterilizante.

Produção das vacinas
A vacina recombinante de subunidade será produzida utilizando o plasmídeo pAE/Q1 previamente construído. Brevemente, o plasmídeo recombinante será usado para transformação de E. coli BL21 (DE3) STAR e a expressão da proteína será induzida com 1 mM de IPTG. A purificação da proteína, nomeada rQ1, será realizada por cromatografia de afinidade ao níquel em coluna de sepharose (HisTrap) e sua pureza será determinada através de SDS-PAGE e a concentração de proteínas pelo Kit BCA (Pierce). Para produção da vacina vetorizada por M. bovis BCG, a cepa rBCG (pUP500/PpAN:Q1) previamente construída será cultivada em meio seletivo Middlebrook 7H9 (Difco), adicionado de 0,05% de Tween 80, 0,2% de glicerol, 10% de OADC e 25 μg.mL-1 de canamicina à 37 °C até atingir densidade ótica de 0,6 – 0,8, quando o cultivo será centrifugado, e o pellet será ressuspendido em PBS com concentração ajustada para 107 UFC/mL.

Vacinação de hamsters sírios
Grupos de 6-8 hamsters sírios de 6 semanas de idade serão vacinados conforme segue: grupo 1 - rQ1 purificada; grupo 2 – rBCG/Q1; grupo 3 – salina (controle negativo); grupo 4 – BCG Pasteur (controle negativo). As vacinas de subunidade e BCG recombinante serão administradas em duas doses, com 21 dias de intervalo, contendo 100 μg de rQ1 e 106 UFC de BCG, respectivamente. O experimento será realizado em três repetições independentes. Todos os procedimentos descritos acima foram submetidos à aprovação pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal da UFPel.

Cultivo de esplenócitos
Os hamsters de todos os grupos experimentais serão eutanasiados no dia 42 do experimento, o baço será coletado e macerado. As células do baço (5x106) serão cultivadas em meio DMEM acrescido de 10% de soro fetal bovino (SFB) em placas de cultivo celular com 24 poços. As células serão incubadas a 37 °C com 5 % CO2 durante 24 horas e serão adicionados os seguintes estímulos: 10 µg de rQ1 livre de endotoxinas, 10 µg de Concanavalina (ConA) (Sigma-Aldrich) e meio DMEM. Após, as células serão novamente incubadas durante aproximadamente 24 horas nas mesmas condições. Os estímulos com ConA e DMEM serão utilizados como controle para o estímulo das células. As células serão coletadas em TRIzol ® reagente (Life Technologies, Carlsbad, California, USA) e o RNA total será extraído utilizando o reagente TRIzol®, conforme instruções do fabricante, e armazenado à – 80 °C até análises posteriores.

Ensaio de proliferação celular
A avaliação da proliferação celular será realizada pelo ensaio colorimétrico de viabilidade celular (MTT). Para isto, as células do baço serão processadas conforme previamente descrito e cultivadas em meio DMEM acrescido de 10% de soro fetal bovino (SFB) em placas de cultivo celular com 96 poços (1x106 células/cavidade). As células serão incubadas à 37 °C com 5 % CO2 durante 24 horas e serão adicionados os seguintes estímulos: 10 µg de rQ1 livre de endotoxinas, 10 µg de Concanavalina (ConA) (Sigma-Aldrich) e meio DMEM. Após, as células serão novamente incubadas durante aproximadamente 72 horas nas mesmas condições. Os estímulos com ConA e DMEM serão utilizados como controles para o estímulo das células. Cerca de 18 h antes do fim do período de incubação será adicionado Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide 98% (Sigma®) e as células serão incubadas por mais 4 h. As absorbâncias serão lidas a 540 nm.

Análise do perfil de expressão de citocinas
O perfil de expressão das citocinas IL-1α, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-12, IFN-ɣ, TGF-β e TNF-α será analisado através de PCR quantitativo em tempo real usando SYBR Green PCR Master Mix e equipamento LightCycler 96 (Roche). A síntese de cDNA será realizada utilizando o kit High-Capacity cDNA Reverse Transcription (Applied Biosystems). A quantificação da expressão será analisada através do método de CT relativo (ΔΔCT), usando o gene β-actina (ΔCT) como controle endógeno (normalizador).

Análise estatística
Análise de variância (ANOVA) será utilizada para determinar diferenças significativas no ensaio de proliferação celular. Diferenças serão consideradas significantes com um valor de P < 0,05. Todas as análises serão conduzidas no software GraphPad Prism 7 (GraphPad Software).

• Produção das vacinas recombinantes e vacinação dos animais;
• Estabelecimento do cultivo de esplenócitos;
• Comparação dos níveis de mRNA de citocinas a partir do cultivo de esplenócitos por qPCR;
• Avaliação da resposta proliferativa dos esplenócitos após estímulos.