Portal InstitucionalUFPEL

CONTEXTUALIZAÇÃO INTITUCIONAL
A Universidade Federal de Pelotas tem atuado no enfrentamento da pandemia COVID-19 através de diversas ações incluindo testagem sorológica, testagem RT PCR, pesquisas pré-clínicas financiadas pela FAPERGS, bem como, através da participação como um dos Centros de Pesquisas Clínicas junto ao Hospital Escola para os testes clínicos da vacina CORONAVAC. Em meados de julho do presente ano, foi criada, junto ao Hospital Escola da UFPel, a Unidade de Diagnostico Molecular RT-PCR para atender a testagem da COVID-19 em pacientes e profissionais da saúde da linha de frente do Hospital Escola (100% SUS) e aos demais hospitais do município. Até o presente momento, já foram realizados cerca de 10.000 testes de monitoramento com 8 mil laudos emitidos. A Unidade de Diagnostico Molecular é coordenada pelo proponente desta proposta, e dispõe de infraestrutura, equipamentos e equipe técnica para análises celular e molecular de amostras clínicas. O laboratório de análises clínicas da Unidade obteve alvará e dispõe de farmacêutico como Responsável Técnico (RT) dos laudos. O Programa de Pós-graduação em Biotecnologia da UFPel (Capes 7), está diretamente envolvido nesta ação, tendo docentes, discentes e profissionais da saúde participando das atividades técnicas direcionadas a aplicação ao SUS.
O HE é um hospital geral, possui serviços de referência regional, com destaque para a alta complexidade em oncologia (UNACON), que apresenta os cenários que contemplam a linha de cuidado na área (oncologia clínica e cirúrgica, onco-hematologia, serviços de quimioterapia e radioterapia, atenção domiciliar e cuidados paliativos). A aproximação da ciência à assistência tem promovido avanços significativos e de impacto social no enfrentamento da COVID-19. A pós-pandemia exigirá um monitoramento constante e refinado tanto de pacientes como dos profissionais de saúde, afim de trazer mais segurança em saúde para todos os envolvidos. Neste contexto, estudos focados em esclarecer possíveis fatores de risco para o desenvolvimento de eventos clinicamente severos decorrentes da infecção por SARS-CoV-2 representa uma área de extrema importância. A associação entre COVID-19 e câncer, mais especificamente, merece destaque por neoplasias representarem um problema de saúde mundial devido à sua alta mortalidade e constante aumento do número de casos. Dessa forma, o estudo da prevalência de mutações em genes relacionados à internalização do vírus em pacientes oncológicos, seguido de acompanhamento dos mesmos, se torna de extrema importância para elucidar o mecanismo principal relacionado a essa comorbidade. Este refinamento genômico clínico, abre a luz da assistência, caminhos de diagnóstico de precisão com potencial aplicação ao SUS. Os critérios de inclusão serão: 1) pacientes oncológicos usuários do SUS atendidos no Hospital Escola da UFPel (Unidade de internação e ambulatorial) ou 2) profissionais da áreada saúde que estejam atuando na linha de frente ao combate do COVID-19 do Hospital Escola da UFPel, e 3) aceite em participar do estudo por meio da concordância e assinatura do termo de consentimento livre e esclarecido (TCLE). Os critérios de exclusão foram definidos como os seguintes: 1) pacientes usuários do SUS atendidos no Hospital Escola daUFPel que não possuem diagnóstico definitivo de neoplasia maligna 2) profissionais da áreada saúde do Hospital Escola da UFPel não atuantes na linha de frente ao combate da COVID19.

Coleta de amostras biológicas
As amostras a serem utilizadas neste projeto serão obtidas conforme descritivo aprovado junto ao comitê de ética em pesquisa da UFPel via plataforma Brasil. As coletas serão feitas junto ao Hospital Escola (HE) da Universidade Federal de Pelotas (UFPel), o qual faz parte do Sistema Único de Saúde (SUS), e monitoradas via fluxo da vigilancia epidemiologica do municipio. Assim, após a assinatura do termo de consentimento pelos pacientes oncológicos será realizada a coleta nasofaríngea, através do método swabs combinados. As coletas serão realizadas pela equipe de enfermagem devidamente treinada junto ao Centro de Pesquisa Clínica do HE. Os swabs serão armazenados em tubos tipo falcon estéreis, previamente rotulados, contendo o meio de transporte. Em seguida, as amostras serão encaminhadas ao laboratório para realização da extração de RNA viral e DNA humano.As amostras biológicas obtidas serão utilizadas tanto para genotipagem de polimorfismos quanto para diagnóstico e sequenciamento viral.
OncoBank
Extração de DNA humano
Para a extração de DNA humano a partir das amostras de swab de pacientes oncológicos, será utilizado o kit QIAamp DNA Mini (Qiagen©), de acordo com instruções do fabricante. Brevemente, serão utilizadas swabs coletadas de pacientes oncológicos. Tais amostras serão submetidas a digestão e purificação do DNA seguido de lavagem e eluição. O kit será suplementado com RNAse A a fim de obter DNA genômico livre de RNA. A qualidade e concentração do DNA serão avaliados utilizando o NanoVue (GE HealthcareLife Sciences) para confirmar o valor de A260/A280 entre 1,8 e 2,0 e concentração maior de 100 ng/µl. Por fim, amostras de DNA usadas para sequenciamento serão analisadas por fluorimetria no equipamento Qubit (Thermo Fisher Scientific), utilizando ensaio de alta sensibilidade.
Biorrepositório de DNA de pacientes oncológicos
Após o isolamento do DNA, as amostras serão alocadas em tubos previamente esterilizados e devidamente identificados com o nome do paciente e outras informações de identificação. Posteriormente, serão armazenados em ultra freezer com temperatura de -70ºC, onde farão parte do biorrepositório de DNA de pacientes oncológicos que será submetido à genotipagem dos polimorfismos. O acesso ao ultrafreezer é restrito aos colaboradores autorizados, mediante utilização de senha de acesso. Os colaboradores assinarão termo de confidencialidade, garantindo o sigilo das informações associadas às amostras do
biorrepositório. O biorrepositório de DNA de pacientes oncológicos, proposto pelo presente projeto, possui grande potencial tanto para as avaliações apontadas neste documento (detecção de polimorfismos nos genes ace-1 e ace-2) quanto como fonte de armazenamento de amostras biológicas para futuros projetos. A localização privilegiada da unidade de diagnóstico molecular UFPel COVID-19, dentro da unidade oncológica do Hospital Escola da UFPel, possibilita o fácil acesso a amostras de pacientes oncológicos. Assim, viabilizando a criação de um biorrepositório de DNA de amostras biológicas de alto valor.
5.2.3 Genotipagem dos polimorfismos nos genes ace1 e ace2
A detecção de amostras com polimorfismo de nucleotídeo único (SNP) no gene ace2 será realizada utilizando a técnica de genotipagem por High Resolution Melting (HRM). Para tal, primers amplificando a região do ACE2 serão desenhados no programa Primer3, versão 0.4.0, disponível em http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/. A reação de HRM será feita utilizando o Brilliant HRM Ultra-Fast Loci Master Mix (Agilent Technologies©), de acordo com as recomendações do fabricante, no sistema de PCR em tempo real Agilent AriaMx (Agilent Technologies©). As condições da reação serão as seguintes: desnaturação inicial a 95 °C por 3 min, seguido por 40 ciclos de amplificação a 95 °C durante 15 seg, 57 °C durante 30 seg e 60 °C durante 30 seg. Os dados da curva de dissociação serão obtidos por aquisição contínua de fluorescência de rampa (aumento controlado de temperatura) desde 65 °C até 95°C com uma resolução de 0,2 °C e um tempo de absorção de 10 segundos. As curvas de dissociação (melting curve) geradas serão analisadas com o software AriaMx Upgrade-High Resolution Melt analysis (Agilent Technologies©). Como HRM é um método de triagem de mutação, amostras com curvas de dissociação anormais identificadas serão submetidas a sequenciamento de Sanger para confirmação da alteração do nucleotídeo específica na
sequência do gene ACE2.
Para a identificação dos genótipos de inserção ou deleção no gene ace1 (rs4646994), serão realizadas reações de PCR convencional utilizando o par de oligonucleotídeos iniciadores.
Extração de RNA viral
A extração de RNA viral será realizada a partir de amostras do trato respiratório
superior e inferior obtidas com o auxílio de swab estéril. As amostras serão colocadasbimediatamente em tubos contendo meio de transporte viral e transportadas para a Unidade de Diagnóstico Molecular UFPel COVID-19. O RNA viral será isolado utilizando o kit IndiMag Pathogen Kit (Indical Bioscience) no extrator automatizado de ácidos nucleicos IndiMag48, conforme instruções do fabricante, e encaminhado ao biorrepositório de RNA viral.
Biorrepositório de RNA viral
Após o isolamento do RNA viral, as amostras serão alocadas em tubos do tipo
eppendorf previamente esterilizados e devidamente identificados com um número de registro interno. Posteriormente, serão armazenados em ultra freezer com temperatura de - 80 ºC, onde irão compor o biorrepositório de RNA viral que será submetido à detecção molecular de SARS-CoV-2. O acesso ao ultrafreezer é restrito aos colaboradores autorizados, mediante utilização de senha de acesso. Os colaboradores assinarão termo de confidencialidade, garantindo o sigilo das informações associadas às amostras do biorrepositório.
Detecção de SARS-CoV-2 por RT-qPCR
Para a detecção molecular de SARS-CoV-2 nos pacientes oncológicos avaliados, será utilizada a técnica de RT-qPCR. Para amplificação dos fragmentos N1 e N2 do gene que codifica a nucleoproteína de SARS-CoV-2, serão adquiridas sondas e primers (IntegratedDNA Technologies, EUA) de acordo com as sequências propostas pelo CDC. Um mix contendo primers e sondas para amplificação do gene da RNAse P humana também seráadquirido, a fim de ser usado como controle da qualidade da amostra e da extração de RNA, conforme recomendado pelo CDC. As reações de RT-qPCR serão preparadas utilizando o kit AgPath-ID™ One-Step RT-PCR (Thermo Fisher Scientific), conforme instruções do fabricante, e realizadas no equipamento AriaMx Real-Time PCR System (Agilent Technologies, EUA). Como controle positivo dos alvos N1 e N2, será utilizado o reagente 2019-nCOV_N positive control (Integrated DNA Technologies, EUA); e como controlepositivo do alvo RNase P, será utilizado um pool de amostras de RNA humano previamente confirmadas como negativas para detecção de SARS-CoV-2.
Sequenciamento do genoma de SARS-CoV-2
Após a confirmação da detecção molecular de SARS-CoV-2 nas amostras provenientes dos pacientes oncológicos, as amostras de RNA serão convertidas a cDNA e posteriormente amplificadas de forma multiplex através de PCR multiplex, utilizando opainel de primers nCov-2019 versão 3 (Integrated DNA Technologies, EUA). Logo após, as amostras serão submetidas ao processo de barcoding para identificação das bibliotecas deacordo com as amostras de origem. O sequenciamento dos genomas será conduzido naplataforma de sequenciamento de nova geração.

O rastreamento de SARS-CoV-2 partir do diagnóstico por RT-PCR no presente projeto está inserido nas ações de enfrentamento da COVID-19, sendo os laudos de diagnósticos diretamente aplicados e utilizados na vigilância epidemiológica do UNIHO-HEUFPEL-EBSERH que é referência em tratamento de câncer na região sul do RS e 100% SUS. Sendo responsável por área que abrange 23 municípios, correspondente aproximadamente a 1milhão de vidas. Ao final deste projeto, espera-se ter estabelecido dois biorrepositórios genômicos: um de amostras de RNA de SARS-CoV-2 (Oncovid) e outro contendo amostras de DNA humano (Oncobank) de pacientes oncológicos usuários do SUS e de profissionais de saúde do Hospital Escola da UFPel. A partir do sequenciamento de nova geração de amostras do biorrepositório Oncovid será possível determinar as variantes virais dos isolados de SARS-CoV-2 circulantes na região sul do RS, permitindo um rastreamento epidemiológico inédito no Rio Grande do Sul. Além disso, espera-se obter dados para elucidação da correlação entre os polimorfismos genéticos e maior susceptibilidade destes pacientes oncológicos de desenvolverem um quadro clínico mais severo de sintomas decorrentes da infecção pelo coronavírus SARS-CoV-2. Acreditamos que análise molecular destes genes alvos pode vir a ser utilizada como uma plataforma genômica de prognóstico a suscetibilidade e severidade da COVID-19 em pacientes oncológicos usuários do SUS. Destaca-se ainda que tais biorrepositórios serão fundamentais não somente para a realização deste projeto, mas principalmente para investigações de monitoramento de outras comorbidades e evolução da doença de base no caso dos pacientes oncológicos. O presente projeto contribuirá ao ensino, pois compreende estudos de teses de doutorado em biotecnologia, contribuirá a ciência, pois através da pesquisa termos uma melhor entendimento das relações genômicas da COVID-19, e contribuirá na assistência em tempo real.