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Embora os mecanismos que provoquem a depressão ainda não estejam bem elucidados, o estresse oxidativo pode desempenhar um importante papel na patofisiologia deste transtorno. Adicionalmente, estudos recentes têm demonstrado uma forte ligação entre a depressão e o envolvimento de um processo inflamatório no sistema nervoso central, o qual é caracterizado pela expressão elevada de citocinas pró-inflamatórias. Estudos pré-clínicos sugerem que antioxidantes, através da sua propriedade de neutralizar espécies reativas e os capazes de modular a neuroinflamação podem exercer atividade antidepressiva. Deste modo, busca-se contribuir com o desenvolvimento de novos tratamentos da depressão.

1. Drogas e reagentes
Microrganismos e condições de cultura
As leveduras Pichia pastoris X-33 serão cultivadas em caldo de levedura peptona dextrose (YPD) durante 16 a 18h a 28 ℃, sob agitação a 200 rpm num agitador orbital. Quinhentos mililitros de inóculo serão adicionados a 7 L de caldo YPD e incubados num biorreactor (Bioflo 110, New Brunswick) a 28℃, 500 rpm, 1 vvm de ar durante 24h. Após a fermentação, as células serão centrifugadas a 5000 × g por 15 min, lavadas em solução salina a 0,9% a 4℃, concentradas 10 vezes e quantificadas. As contagens viáveis serão determinadas colocando diluições decimais de levedura em ágar YPD após incubação a 28 ℃ durante 48h. Aproximadamente 7 log CFU.g −1 de Pichia pastoris X-33 serão administrado pela via intragástrica nos camundongos por 7 dias

2. Animais
Os experimentos serão realizados em camundongos Swiss machos, pesando de 25-30g. Serão mantidos 5 animais por caixa em condições ambientais padrão (22±1 °C e ciclo claro/escuro de 12 h) com livre acesso a água e comida. Todos os procedimentos serão realizados entre as 08:00 e 18:00 h, de acordo com as diretrizes do Comitê de Ética em Experimentação Animal da Universidade Federal de Pelotas (CEEA/UFPel).
Para evitar a influência potencial dos testes comportamentais em níveis de citocinas e estresse oxidativo, os testes in vitro devem ser realizados em diferentes animais (Mello et al, 2013). Uma vez que estudos demonstram que há influência do estresse promovido pelos testes comportamentais e os níveis de citocinas discordando assim com os resultados esperados (Bossu et al, 2012). Deste modo, 48 camundongos serão submetidos a avaliação comportamental, enquanto que 144 animais serão submetidos a análises bioquímicas.

3. Protocolo experimental
O lipopolissacarídeo (LPS) é uma endotoxina presente na membrana externa de bactérias gram negativas (GUHA E MACKMAN, 2001). É utilizado como modelo de estudo de processos neuroinflamatórios, pois induz a produção de mediadores inflamatórios no sistema nervoso central e periférico. Isso decorre ao fato de que o LPS mimetiza a infeção por bactérias gram-negativas que levam a ativação do sistema imune por liberar citocinas pró-inflamatórias como TNF-α, IL-1β, and IL-6. O LPS é constituído por três subunidades: a porção polissacarídica, antígeno O e o lipídeo A que confere a imugeneicidade. Altas concentrações dessa endotoxina pode acarretar na sepse, choque séptico e até mesmo a morte.
O LPS induz o comportamento tipo-depressivo e ansigênico por meio da sua ligação aos receptores tipo-toll 4, presente em células neuronais, astrócitos, micróglia, macrófagos e monócitos.
Os animais receberão uma única injeção intraperitoneal de LPS (0,83 mg/Kg) ou salina (veículo do LPS). Os testes comportamentais serão conduzidos 24 h após o desafio com LPS ou salina. A dose de LPS (0,83 mg/Kg, i.p.) foi escolhida com base em estudos anteriores que avaliaram os parâmetros comportamentais e alterações neuroquímicas associadas a DM em camundongos.
O delineamento experimental: Para a avaliação da Pichia pastoris em prevenir o comportamento tipo-depressivo em camundongos com o possível envolvimento do estresse oxidativo e da neuroinflamação, bem como modular da plasticidade neural
Experimento: Os camundondos Swiss machos desafiados com LPS, bem como os controles (que receberão salina) serão divididos em 4 grupos experimentais:
G1: Controles + Veículo
G2: Controles + Pichia pastoris
G3: LSP + Veículo
G4: LPS + Pichia pastoris
Os animais receberão seu respectivo tratamento (Pichia pastoris ou seu veículo, i.g.) durante 7 dias consecutivos, antes da administração do LPS. No 8º dia os animais receberão LPS (0,83 mg/Kg, i.p.) e após 24h os animais serão avaliados no teste do campo aberto (TCA), teste do nado forçado (TNF) e splash test e posteriormente será realizado eutanásia para retirada das estruturas cerebrais (córtex pré-frontal e hipocampo) para as análises antioxidantes (RS e TBARS), para RT-PCR (TNF-α, NFKβ e IL-1β) e para as análises de Western blot.
4. Ensaios comportamentais
Teste do campo aberto (TCA)
O teste do campo aberto (TCA) é realizado a fim de descartar possíveis alterações na atividade locomotora dos animais nos testes comportamentais. Este teste será realizado em uma caixa (30 x 45 x 45 cm) dividida em 9 quadrantes idênticos. Cada animal será colocado individualmente no centro do aparato e observado por 5 min para registrar o número de cruzamentos com as quatro patas e o número de levantamentos com as patas posteriores(WALSH; CUMMINS, 1976).

Teste do nado forçado (TNF)
O teste de nado forçado (TNF) é um parâmetro comportamental bem aceito para avaliar a atividade do tipo-antidepressiva. Neste teste os animais serão forçados a nadar em um recipiente cilíndrico aberto (10 cm de diâmetro, 25 cm de altura) contendo 19 cm de água há uma temperatura de 25±1 C. Serão avaliados, a latência para o primeiro episódio de imobilidade durante os dois primeiros minutos e o tempo de imobilidade nos próximos quatro minutos (PORSOLT; LE PICHON; JALFRE, 1977).

Splash test
O teste consiste na vaporização de uma solução de sacarose a 10% sobre o dorso de um animal colocado individualmente em um aparato de acrílico (9 x 7 x 11cm). O splash test é um válido marcador comportamental de comportamento anedônico induzido por modelos de depressão, de modo que, após a aplicação de solução de sacarose, o tempo total de auto-limpeza são mensurados durante 5 minutos. Este teste avalia o auto-cuidado e o comportamento motivacional dos animais (HAJ-MIRZAIAN et al., 2015)

Testes bioquímicos
Para avaliação antioxidante
Após a eutanásia, os tecidos serão pesados e mantidos em gelo até a homogeneização em solução de Tris-HCl 50 mM, pH 7,4.

Formação das Espécies Reativas (RS)
O nível de RS será determinado nos tecidos e nas estruturas cerebrais de acordo com (LOETCHUTINAT et al., 2005) O protocolo será baseado na observação de que as espécies reativas são capazes de oxidar o diacetato de diclorofluoresceína a diclorofluoresceína, a qual emite fluorescência, com emissão medida a 520 nm e excitação de 480 nm. Os níveis de RS seão expressos em unidades (U) de fluorescência.

Ensaio das espécies reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS)
Avaliação da peroxidação lipídica atraves do ensaio de TBARS conforme descrito por (OHKAWA; OHISHI; YAGI, 1979). Os níveis de TBARS foi medido espectrofotometricalmente a 532 nm. Os resultados serão expressos em nmol TBARS/g tissue.

Western blot
A técnica de western blot consiste na detecção de proteínas especificas presentes no homogenato. Para isso é necessário a realização de eletroforese 2D, com o intuito das proteínas se diferenciarem pelo ponto isoelétrico, e posteriormente transferidas a uma membrana de nitrocelulose onde são detectadas utilizando anticorpos para a proteína alvo. As proteínas que serão avaliadas estão listadas de acordo com os anticorpos abaixo:

Tabela 1. Lista dos anticorpos utilizados para a realização do projeto:
Plasticidade sináptica
1. AKT
2. BDNF
3. CREB

RT-PCR
O RNA total será purificado das estruturas cerebrais (cortex pré-frontal e hipocompo) utilizando o reagente Trizol. A síntese de cDNA será realizada com 1 µg de RNA usando o kit de Transcrição Reversa de cDNA de Alta Capacidade de acordo com o protocolo do fabricante. Utilizará o Master Mix SYBR Green PCR para a realização de qRT-PCR em tempo real, de acordo com o protocolo do fabricante. Os valores relativos da expressão gênica serão normalizados usando GAPDH e as condições para a reação incluíram 95◦C por 15 s, 60◦C por 60 s e 72◦C por 30 s. Os genes estão listados na Tabela 2.

Tabela 2. Lista dos genes utilizados para a realização do projeto:
Neuroinflamação
1. IL-1β
2. NFκB
3. TNF-α
4. BDNF

Análises Estatísticas
Os resultados serão expressos como media ± desvio padrão e considerados significativos quando p<0,005. As análises estatísticas serão realizadas pela análise de variância de uma via (ANOVA) ou de duas vias, seguidas pelo testes de post hoc de Newmam-Keuls ou Bonferroni’s quando apropriado, através do software GraphPad Prism 5.0.

Considerando que a DM tem afetada cada vez mais a população, sendo considerada a segunda maior causa de incapacidade do mundo, é justificável a crescente atenção relacionada ao estudo de mecanismos de ação envolvidos na farmacologia de novas moléculas com potencial terapêutico deste transtorno. Desta maneira, uma variedade de modelos explicativos vem sendo proposta, entre elas está o desafio com LPS.
Nesse sentido, neste projeto pretende-se buscar uma nova alternativa para o tratamento de pacientes com DM que sejam eficazes e que apresentem menos efeitos adversos. Com isso, este estudo permitirá a melhor compreensão tanto dos mecanismos pelos quais o LPS leva ao desenvolvimento do comportamento tipo-depressivo em camundongos.
Tendo em vista a experiência do nosso grupo de pesquisa em avaliar a atividade farmacológica e toxicológica de moléculas bioativas, espera-se que ao final do presente projeto seja identificada uma nova alternativa promissora para auxiliar no tratamento da DM. E justificando que a fisiopaltologia da DM está intimamente relacionada com a alteração na microbiota intestinal, espera-se que o pré tratamento com probiótico seja eficaz em prevenir o aparecimento de sintomas depressivos.
O projeto é inovador e de alto impacto tecnológico pois contribuirá com o fortalecimento da ciência frente as descobertas que acercam os compostos em questão, contribuindo com a clarificação dos mecanismos de ação da molécula e melhor compreensão da DM. Além disso, viabiliza desenvolvimento de fármacos mais eficazes, contribuindo não só para o bem-estar do paciente, como também para a redução dos custos de tratamento. O objetivo deste trabalho é a caracterização de um probiótico como um possível tratamento para a DM, e a partir destas informações, abrir fronteiras para a busca de novos tratamentos para desta patologia, contribuindo com a sociedade científica e tecnológica para a inovação no ramo, através da geração de produtos e patentes que pode ser bastante relevante para o crescimento tecnológico e inovador do Brasil.
Diante do exposto, espera-se que o probiótico previna os danos causados pela inflamação causada pela LPS, bem como os efeitos depressivos causados pelo mesmo.