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A Tacrina é um composto químico capaz de inibir a AChE, enzima responsável por degradar a acetilcolina (ACh) em colina e acetato. A ACh é um neurotransmissor envolvido em vários mecanismos, incluindo na formação de novas memórias e na cognição. Segundo Lushington e colaboradores (2006) a estrutura da AChE é substancialmente conservada entre a espécie humana (Homo sapiens, hAChE) e os camundongos (Mus musculus, MmAChE), possuindo identidade de 88% e homologia na sequência de aminoácidos de 97%, o que torna este animal interessante para o estudo do efeito de fármacos inibidores da AChE. Em pacientes com a DA, o nível da colina acetiltransferase, enzima responsável pela síntese de ACh, apresenta-se diminuído e a enzima AChE contribui para a diminuição da disponibilidade do neurotransmissor ACh.
Aprovada nos Estados Unidos como o primeiro fármaco a inibir a AChE, a Tacrina ficou mais de 20 anos no mercado até ser proibida pela FDA na década de 1990. Apesar de efetiva em restaurar a cognição em pacientes com DA, a dose recomendada para uso demonstrou-se hepatotóxica, levando ao aumento da aspartato aminotransferase (AST) e sintomas como náusea severa e vômito nos pacientes que faziam uso do medicamento. Nos últimos anos, diversos estudos com híbridos de Tacrina foram realizados, em que muitos deles apresentaram redução do efeito do composto ou continuaram apresentando efeitos hepatotóxicos.
Na última década, diversos estudos envolvendo derivados híbridos da Tacrina têm sido realizados para reduzir seus efeitos colaterais adversos, ao mesmo tempo que mantém sua propriedade inibitória da AChE
(CHEN et al., 2012; LI et al., 2018; LI et al., 2020; NEPOVIMOVA et al., 2021; REDDY et al., 2017; Zhang et al., 2016). Neste projeto, propõe-se a avaliação de um híbrido de Tacrina e selênio, o Tse. O selênio é um micronutriente essencial e está presente como cofator de enzimas antioxidantes como GPx e certas formas de tiorredoxina redutase (Trx) (ZOIDIS et al., 2018). Os seus efeitos podem ser atribuídos também à prevenção de toxicidade, onde vários compostos hibridizados com este micronutrientes obtiveram redução de hepatotoxicidade (EBAID et al., 2021; KHURANA et al., 2019). No entanto, as propriedades do composto TSe ainda não foram estudadas quanto aos seus mecanismos de ação como um fármaco multipotente para o tratamento da DA e depressão. Portanto, o presente projeto propõe elucidar os efeitos do composto TSe
em reverter o déficit cognitivo e de memória e o comportamento tipo depressivo induzido por STZ em camundongos machos e fêmeas. Inúmeros aspectos da fisiopatologia da DA foram observados após a administração de STZ pela via intracerebroventricular (KAR et al. 2004; RAVELLI et al. 2016). Este composto é sintetizado pela bactéria Gram-positiva Streptomycetes achromogenes e sua utilização é muito difundida em estudos de indução da diabetes sistêmica em camundongos não-transgênicos devido à capacidade em causar danos às células β-pancreáticas, de modo a induzir a resistência à insulina (CHEN et al., 2013). Nesse sentido, o hipometabolismo da glicose também está relacionado aos sinais precoces da DA. Além do dano cerebral devido a deficiência de glicose, uma molécula essencial para o metabolismo energético, e da resistência à insulina, a STZ também está associada ao aumento da atividade da AChE, hiperfosforilação da proteína TAU e favorecimento da formação de placas β-amiloide (LI et al., 2020), considerado um dos principais biomarcadores da DA.
Adicionalmente, será investigado o efeito do TSe na modulação das respostas fisiológicas ao estresse oxidativo, o qual tem sido amplamente relatado em roedores induzidos através de STZ (CHEN et al., 2013; CHOI et al., 2020; JAVED et al., 2012; LATINA et al., 2021). Um estudo atribuiu o estresse oxidativo como um fator que contribui para o desenvolvimento e progressão de diversas patologias incluindo a DA e depressão (JUSZCZYK et al., 2021).
A depressão é um transtorno mental debilitante que afeta 280 milhões de pessoas no mundo (WHO, 2021), causando prejuízos emocionais e físicos aos pacientes acometidos por ela e aqueles com DA, os quais frequentemente possuem depressão como comorbidade (MARTÍN-SÁNCHEZ et al., 2021). Desta maneira, encontrar um novo fármaco o qual possa atuar no déficit cognitivo e que possui atividade tipo antidepressiva mostra-se como uma estratégia para reduzir os efeitos adversos causados pela a administração medicamentosa de múltiplos fármacos. O estresse oxidativo é um dos mecanismos que podem explicar o desenvolvimento da depressão, e está presente também na DA, o que faz com que essas doenças possam ser desenvolvidas como comorbidades (RODRIGUES et al., 2015). O estresse oxidativo é marcado pelo desequilíbrio nos mecanismos pró e antioxidantes do organismo, e consequente aumento de ER levando à oxidação de biomoléculas como DNA, proteínas e lipídios, sendo que este último pode ser mensurado através do ensaio TBARS (BAJPAI et al., 2014). Como resultado, observa-se uma neurodegeneração, e a administração de STZ no cérebro acarreta em um aumento de ER (SAXENA et al., 2011). A atividade adequada das enzimas antioxidantes, como CAT, SOD e GPx possuem um importante papel na reversão do estresse oxidativo. No transtorno depressivo, diversas monoaminas (catecolaminas como dopamina, norepinefrina, epinefrina oriundas da tirosina; a serotonina do triptofano e histamina da histidina) são degradadas através da enzima MAO. Esta enzima pode ser dividida em dois tipos, A e B. A MAO-A e MAO-B degradam as monoaminas, sendo a dopamina preferencialmente metabolizada pela MAO-B, e a serotonina pela a MAO-A (YEUNG et al., 2019). A MAO pode ser ativada através do estresse oxidativo, resultando na diminuição de neurotransmissores capazes de garantir a homeostase e o bem estar dos indivíduos portadores deste transtorno. Curiosamente, pacientes depressivos possuem diminuição da serotonina, degradada pela a MAO-A (YOUDIM & BAKHLE, 2006), e pacientes com DA possuem diminuição da dopamina, degradada pela MAO-B (TZVETKOV & ATANASOV, 2018). Portanto, um fármaco antioxidante capaz de reduzir os níveis de ER, TBARS e a atividade da MAO, e elevar os níveis da atividade de SOD, CAT e GPx é de extrema importância para a saúde mental dos pacientes que possam apresentar a DA e a depressão como comorbidade.
Em vista disso, apesar da tendência crescente em substituir-se a experimentação in vivo por métodos alternativos, o uso de modelos animais ainda é fundamental para obtenção de resultados mais acurados quanto ao efeito do tratamento sob as complexas vias metabólicas do organismo, as quais ainda não podem ser replicadas por outras técnicas. Portanto, o uso de camundongos, um modelo já consolidado para o estudo de desordens psiquiátricas (BORSINI et al., 2002), será necessário para o presente estudo. Vale ressaltar, os cálculos para a definição do número de animais a serem utilizados (os quais são apresentados no item 9.6) basearam-se no princípio dos 3R’s, do inglês replace, que se refere a substituição de animais sencientes, ou seja, capazes de percepção através dos sentidos; reduction, que se traduz para a redução do número de animais utilizados, sem comprometer a confiabilidade experimental e refinement, que significa refinar as técnicas para minimizar o estresse e severidade de procedimentos aplicados, a fim de garantir um maior bem-estar ao animal.

Primeiramente (Protocolo 1) será realizada a avaliação in vitro por meio dos ensaios das espécies reativas ao oxigênio (ROS) e das substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) em córtex pré-frontal e hipocampo de camundongos para investigar a capacidade do composto em reduzir a formação de espécies reativas de oxigênio e a peroxidação lipídica, respectivamente. Ainda será realizado o ensaio para avaliação da capacidade dos compostos em inibir a atividade da acetilcolinesterase (AChE), e o ensaio monoamina oxidase (MAO) para avaliar a inibição da degradação da acetilcolina e da oxidação de monoaminas (neurotransmissores monoaminérgicos) em córtex e hipocampo (Figura 3). O ensaio de Bradford será realizado para verificar a quantificação de proteínas nas amostras de tecidos cerebrais. O ensaio da MAO
será realizado, pois este trabalho também visa avaliar a atividade antidepressiva do composto, uma vez que a depressão é uma comorbidade encontrada em muitos pacientes com DA.

O protocolo 2 tem como objetivo avaliar o efeito tipo antialzheimer do composto Tse em comparação com a Tacrina em camundongos Swiss (25-35g) machos e fêmeas, submetidos a administração via intracerebroventricular (i.c.v.) com STZ (3 mg/Kg diluída em 25 mg/mL de salina 0.9%) nos dias 1 e 3, conforme figura 4. Transcorridos 21 dias após a i.c.v, os camundongos serão submetidos ao tratamento pela via intragástrica (i.g.) com a Tacrina (10 mg/Kg), TSe (10 mg/Kg), ou óleo de canola (10 mL/Kg, veículo dos compostos) durante um período de 20 dias. Este período entre a indução e o tratamento é necessário para a ocorrência do processo neurodegenerativo que será posteriormente avaliado. O efeito tipo antialzhimer do composto TSe será avaliado nos dias 44, 43 e 46, através testes comportamentais de open field (OF), labirinto em Y e teste do reconhecimento de objetos (TRO), sendo que no último dia de testes será realizada a eutanásia por overdose de inalação de isoflurano, seguido da confirmação por deslocamento cervical e retirada de tecidos (córtex pré-frontal (CPF), hipocampo (HC)) para a realização dos teste bioquímicos para avaliação dos níveis espécies reativas (ER), substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS), AChE tecidual, reação em cadeia da polimerase em tempo real (RT-PCR) e quantificação da proteína pelo método Bradford.

Uma vez que a DA e a depressão são comorbidades altamente associadas, o protocolo experimental 3 tem como objetivo avaliar o efeito tipo antidepressivo do composto TSe em comparação com a Tacrina em camundongos Swiss (25-35g) machos e fêmeas submetidos a administração via i.c.v de STZ (3 mg/Kg diluída em 25 mg/mL de salina 0.9%) nos dias 1 e 3 (Figura 5). Após transcorridos 21 dias após a i.c.v., os camundongos serão submetidos ao tratamento com a Tacrina (10 mg/Kg. i.g.), TSe (10 mg/Kg, i.g.), ou óleo de canola (10 mL/Kg, i.g.) durante um período de 20 dias. O efeito tipo antidepressivo do composto TSe será avaliado no dia 46, através dos testes comportamentais de OF, teste da suspensão da cauda (TSC), Splash test e teste do nado forçado (TNF). Posteriormente os animais serão eutanasiados por overdose de inalação de isoflurano, confirmado por deslocamento cervical, seguido pela retirada de tecido (CPF, HC) para a realização dos testes bioquímicos para avaliação da atividade das enzimas antioxidantes superóxido-dismutase (SOD), catalase (CAT) e glutationa peroxidase (GPx), da enzima monoamina oxidase (MAO), RT-PCR e quantificação da proteína pelo método Bradford.

Espera-se que o composto TSe apresente atividade farmacológica relevante sobre o sistema nervoso central, com potencial antioxidante e inibição das enzimas AChE e MAO em ensaios in vitro. Nos experimentos in vivo, espera-se que o tratamento com TSe melhore o desempenho cognitivo e reduza comportamentos do tipo depressivo em camundongos submetidos ao modelo de DA induzido por STZ, com eficácia comparável ou superior à tacrina. Além disso, prevê-se que o TSe apresente menor toxicidade hepática, preservando os marcadores bioquímicos e histológicos de integridade tecidual. De modo geral, os resultados devem contribuir para a compreensão dos efeitos neuroprotetores de derivados da tacrina e apoiar o desenvolvimento de novos candidatos terapêuticos mais seguros para o tratamento de doenças neurodegenerativas e transtornos neuropsiquiátricos.