Nome do Projeto
O efeito probiótico da Komagataella pastoris KM71H como alternativa profilática da ansiedade induzida por estresse em camundongos
Ênfase
Pesquisa
Data inicial - Data final
29/10/2025 - 01/12/2027
Unidade de Origem
Coordenador Atual
Área CNPq
Ciências Biológicas
Resumo
O avanço do conhecimento científico, congregando áreas como psiquiatria, nutrição, gastrenterologia e neurologia, tem firmado como certa a comunicação bioquímica extensiva entre o sistema nervoso central (SNC) e o trato gastrointestinal. Nesse contexto, emerge o conceito do eixo intestino-cérebro, propondo não apenas a influência do cérebro na função intestinal, mas também a capacidade do intestino de desencadear modificações no SNC (GRENHAM et al, 2011). Dessa forma, o eixo intestino-cérebro tem sido adotado para caracterizar a intricada comunicação entre o intestino e o SNC, desempenhando um papel crucial na regulação das funções imunológicas, endócrinas e neurais. Este conceito revela-se fundamental para compreender as interações complexas entre os sistemas gastrointestinais e neurológicos, evidenciando a sua relevância na modulação de processos fisiológicos cruciais para a homeostase do organismo (BIRMANN et al, 2021).
Investigações científicas têm fornecido evidências de que a microbiota intestinal exerce funções vitais que influenciam a integridade da barreira intestinal, a liberação de citocinas, a modulação da inflamação intestinal e a restauração da arquitetura de suas junções celulares estreitas (MINAYO et al, 2021) e, recentemente, pesquisas têm destacado as interconexões entre modificações no microbioma entérico e distúrbios psiquiátricos, abrindo caminho para o desenvolvimento de abordagens terapêuticas inovadoras (MINAYO et al, 2021). De acordo com um estudo da Organização Mundial da Saúde (OMS), o Brasil lidera mundialmente na prevalência de transtornos de ansiedade, afetando 9,3% da população. Esses dados destacam a importância de investigar novas estratégias terapêuticas.
Em estudos anteriores, foi comprovado o potencial probiótico da levedura Komagataella pastoris KM71H e observado o efeito tipo antidepressivo em sua administração, que pode estar relacionado à capacidade desta levedura em diminuir níveis plasmáticos de corticosterona, prevenir o aumento da permeabilidade da barreira hematoencefálica e modular a expressão de genes inflamatórios (BIRMANN et al, 2021), características importantes também na regulação da ansiedade. Assim, este projeto busca explorar os potenciais benefícios do probiótico Komagataella Pastoris KM71H na mitigação dos efeitos da ansiedade induzida por estresse em modelo animal. Para isto, os camundongos Swiss de 4 a 6 semanas serão administrados com K. pastoris KM71H na dose de 1x108 Unidades Formadoras de Colônia (UFC) ou PBS durante 14 dias. Após esse período, no dia 15, será induzido o comporramento tipo-ansioso por meio de protocolo de Estresse Agudo de Restrição (EAR). Ao final do protocolo experimental os animais serão avaliados através dos seguintes testes comportamentais: teste do campo aberto, teste do labirinto em cruz elevado, teste claro/escuro e teste marble burying. Por fim, os animais serão submetidos à eutanásia para a extração de tecidos e sangue. Os seguintes testes bioquímicos e moleculares serão realizados após o protocolo apresentado: Ensaio das Espécies Reativas (ER), Atividade da Catalase (CAT), Atividade da Superóxido Dismutase (SOD), Ensaio das Espécies Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico (TBARS), Óxido Nítrico (ON), Níveis de Corticosterona Plasmática (CORT), Monoamina Oxidase (MAO), Reação em Cadeia da Polimerase Reversa (RT-PCR) e Western Blot (WB).
Objetivo Geral
O objetivo do presente trabalho consiste na elucidação da atividade probiótica da Komagataella pastoris KM71H na profilaxia do transtorno de ansiedade em modelos animais que mimetizam o comportamento tipo-ansioso e os mecanismos bioquímicos e moleculares relacionados com esses efeitos.
Justificativa
A experimentação científica no ramo da biologia comportamental depende fortemente do uso de modelos animais validados para o estudo dos mecanismos correspondentes. Dentre os animais modelo existentes, os camundongos são os mais caracterizados e utilizados. Essa espécie animal possui inúmeras vantagens em relação às outras, como a facilidade de manuseio, facilidade de execução dos testes, e semelhança biológica e fisiológica que permite a correlação dos resultados com dados humanos. Mesmo com o progresso de métodos alternativos nos últimos anos (como estudos in vitro e culturas de células), os modelos animais ainda apresentam como principal vantagem o fornecimento de informações sobre o organismo como um todo, fato que não é conseguido com outros métodos. Além disso, os camundongos já estão consolidados como uma ferramenta de estudo de desordens psiquiátricas, já que se pode notar um crescimento constante no número de laboratórios que trabalham com esse modelo (BORSINI et al, 2002). Vale destacar que todos os cálculos referentes ao número de animais a serem utilizados foram baseados no princípio dos 3R’s. Isto é, “replace”, que se traduz por substituir os animais sencientes, ou seja, capazes de experimentar dor, prazer, felicidade, medo, frustração e ansiedade; “reduction”, que significa reduzir o número de animais usados, sem prejudicar a confiabilidade dos resultados e “refinement” que quer dizer refinamento, ou seja, a diminuição da incidência ou severidade de procedimentos aplicados, garantindo o bem estar do animal.
Embora os mecanismos que provoquem a ansiedade ainda não estejam bem elucidados, o estresse oxidativo pode desempenhar um importante papel na patofisiologia deste transtorno. Adicionalmente, estudos recentes têm demonstrado uma forte ligação entre a ansiedade e o envolvimento de um processo inflamatório no sistema nervoso central, o qual é caracterizado pela expressão elevada de citocinas pró-inflamatórias. Estudos pré-clínicos sugerem que antioxidantes, através da sua propriedade de neutralizar espécies reativas, são capazes de modular a neuroinflamação e, por isso, podem ser capazes de exercer atividade ansiolítica. Deste modo, busca-se contribuir com o desenvolvimento de novos tratamentos da ansiedade.
Embora os mecanismos que provoquem a ansiedade ainda não estejam bem elucidados, o estresse oxidativo pode desempenhar um importante papel na patofisiologia deste transtorno. Adicionalmente, estudos recentes têm demonstrado uma forte ligação entre a ansiedade e o envolvimento de um processo inflamatório no sistema nervoso central, o qual é caracterizado pela expressão elevada de citocinas pró-inflamatórias. Estudos pré-clínicos sugerem que antioxidantes, através da sua propriedade de neutralizar espécies reativas, são capazes de modular a neuroinflamação e, por isso, podem ser capazes de exercer atividade ansiolítica. Deste modo, busca-se contribuir com o desenvolvimento de novos tratamentos da ansiedade.
Metodologia
Os camundongos Swiss de 4 a 6 semanas receberão K. pastoris KM71H na dose de 1x108 Unidades Formadoras de Colônia (UFC) ou PBS durante 14 dias. Após esse período, no dia 15, serão induzidos por meio de protocolo de EAR, após serão avaliados pelos testes comportamentais (teste do campo aberto, teste do labirinto em cruz elevado, teste claro/escuro e teste marble burying) e posteriormente submetidos à eutanásia para a extração de tecidos e sangue. Os testes bioquímicos e moleculares serão realizados após o protocolo apresentado.
O protocolo experimental foi baseado em estudos que utilizaram a mesma metodologia e, apesar de diversos artigos publicados utilizarem apenas camundongos ou ratos machos, nosso intuito é utilizar juntamente as fêmeas, a fim de analisar possíveis alterações de resultados entre os sexos e evidenciar dados de outros estudos com diferentes propostas, que apresentaram a efetividade da indução e presença de comportamento tipo-ansioso em ambos os sexos (BOTTERILl et. al, 2021; BRITZOLAKI et al, 2021). Assim, também contribuiremos com os termos de utilização dos animais ao não ter a necessidade de descartar as fêmeas e, consequentemente, tornando nosso estudo mais abrangente.
Um grupo de animais diferentes deverá ser utilizado para realizar as análises antioxidantes (ER, TBARS), um grupo para fazer a avaliação do óxido nítrico, um grupo para a monoamina oxidase, um grupo para a superóxido desmutase (SOD), um grupo para realizar a técnica de RT-PCR e um grupo para o Western Blot, devido às diferenças nos reagentes de extração, conforme descrito na tabela do item 9.6. Para as análises de estresse oxidativo é necessário utilizar o tampão Tris/HCl 50 mM; para a atividade da superóxido desmutase (SOD) será utilizado tampão carbonato de sódio 50 mM, para a monoamina oxidase será utilizado meio Na2PO4/KH2PO4 e isotonizado com sacarose para homogeneização, para o óxido nítrico é necessário utilizar o tampão TFK; para o RT-PCR é utilizado o reagente Trizol e para o Western Blot é utilizado o reagente RIPA para a homogeneização das amostras de hipocampo, córtex e intestino. Como são 6 tampões diferentes para 6 testes diferentes, é necessário extrair 6 vezes de 80 tecidos totalizando 480 amostras de cada tecido.
O protocolo experimental foi baseado em estudos que utilizaram a mesma metodologia e, apesar de diversos artigos publicados utilizarem apenas camundongos ou ratos machos, nosso intuito é utilizar juntamente as fêmeas, a fim de analisar possíveis alterações de resultados entre os sexos e evidenciar dados de outros estudos com diferentes propostas, que apresentaram a efetividade da indução e presença de comportamento tipo-ansioso em ambos os sexos (BOTTERILl et. al, 2021; BRITZOLAKI et al, 2021). Assim, também contribuiremos com os termos de utilização dos animais ao não ter a necessidade de descartar as fêmeas e, consequentemente, tornando nosso estudo mais abrangente.
Um grupo de animais diferentes deverá ser utilizado para realizar as análises antioxidantes (ER, TBARS), um grupo para fazer a avaliação do óxido nítrico, um grupo para a monoamina oxidase, um grupo para a superóxido desmutase (SOD), um grupo para realizar a técnica de RT-PCR e um grupo para o Western Blot, devido às diferenças nos reagentes de extração, conforme descrito na tabela do item 9.6. Para as análises de estresse oxidativo é necessário utilizar o tampão Tris/HCl 50 mM; para a atividade da superóxido desmutase (SOD) será utilizado tampão carbonato de sódio 50 mM, para a monoamina oxidase será utilizado meio Na2PO4/KH2PO4 e isotonizado com sacarose para homogeneização, para o óxido nítrico é necessário utilizar o tampão TFK; para o RT-PCR é utilizado o reagente Trizol e para o Western Blot é utilizado o reagente RIPA para a homogeneização das amostras de hipocampo, córtex e intestino. Como são 6 tampões diferentes para 6 testes diferentes, é necessário extrair 6 vezes de 80 tecidos totalizando 480 amostras de cada tecido.
Indicadores, Metas e Resultados
Espera-se que o tratamento profilático com a levedura Komagataella pastoris KM71H exerça efeito ansiolítico em camundongos submetidos ao estresse agudo de restrição, evidenciado pela melhora nos parâmetros comportamentais. Do ponto de vista bioquímico e molecular, prevê-se que o tratamento com K. pastoris reduza o estresse oxidativo e a neuroinflamação, por meio da modulação da atividade de enzimas antioxidantes (CAT, SOD), da diminuição de espécies reativas (ER, TBARS) e da regulação de citocinas pró-inflamatórias. Além disso, espera-se observar menores níveis plasmáticos de corticosterona e alterações benéficas na expressão de genes e proteínas associadas ao eixo hipotálamo-pituitária-adrenal e à plasticidade neural. Dessa forma, o projeto poderá contribuir para o entendimento dos mecanismos psicobióticos associados à K. pastoris KM71H e para o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas no tratamento de transtornos de ansiedade.
Equipe do Projeto
| Nome | CH Semanal | Data inicial | Data final |
|---|---|---|---|
| AMANDA BORGES LIMA | |||
| LAUREN NETTO PUJOL | |||
| LUCIELLI SAVEGNAGO | 4 | ||
| RAFAELA XAVIER DE MORAES | |||
| RENATA LEIVAS DE OLIVEIRA |