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A crescente demanda por produtos de origem animal, aliada à necessidade de aumento da eficiência produtiva nos sistemas de criação, tem impulsionado o desenvolvimento e a aplicação de biotecnologias reprodutivas na ovinocultura (Khan et al., 2022). Dentre essas biotecnologias, a indução de múltiplas ovulações (superovulação; SOV) e transferência de embriões (TE) destaca-se como ferramenta promissora para o rápido avanço genético e multiplicação de matrizes de alto valor zootécnico (Cognié et al., 2003). O princípio da SOV está baseado em estratégias de contorno dos mecanismos de dominância folicular de modo a permitir que folículos destinados a atresia consigam ovular, proporcionando que fêmeas zootecnicamente importantes (doadoras), produzam maiores quantidades de embriões em um ciclo. Estes embriões por sua vez, devem ser coletados do útero das doadoras e inovulados em fêmeas comuns (receptoras), que gestarão os produtos das doadoras.
Apesar da SOV estar bem estabelecida em algumas espécies, em ovinos essa biotécnica ainda tem sua eficiência limitada por fatores como a variabilidade individual na resposta superovulatória e baixa taxa de recuperação embrionária (González-Bulnes et al., 2004). Esses entraves estão relacionados a fatores fisiológicos, ambientais, sanitários e ao protocolo hormonal utilizado (Menchaca et al., 2010). Além disso, existe grande variação nos protocolos hormonais utilizados para esta finalidade, especialmente em relação ao tipo de gonadotrofina utilizada, dose e momento da aplicação (Dias et al., 2023).
Os protocolos de SOV em ruminantes têm como principal etapa a aplicação de hormônios que estimulam o crescimento folicular, tais como a gonadotrofina menopáusica humana (hMG), gonadotrofina coriônica equina (eCG) e o hormônio folículo estimulante (FSH). Destes, os mais facilmente empregáveis são a eCG (obtido da purificação de sangue de éguas gestantes) e o FSH (obtido de hipófises ovinas ou suínas provenientes de abatedouro). O FSH tem como principal limitação o fato de depender de aplicações repetidas em doses constantes ou decrescente com intervalo de 12 h (Bó et al., 2002), devido a meia-vida curta deste hormônio (Demoustier et al., 1988). Já a eCG, que em ruminantes se liga aos receptores de FSH e LH dos folículos (Murphy, 2012), não apresenta tal limitação por ser uma molécula grande com meia vida mais longa. Porém, a utilização desta molécula está associada a formação de folículos anovulatórios (Azawi; Al-Mola, 2011). Contudo, com o avanço da tecnologia de DNA recombinante e a crescente demanda comercial por alternativas capazes de modular a dinâmica folicular nas espécies economicamente importantes, foram desenvolvidas várias abordagens para obtenção de eCG e FSH recombinantes. Dentre as alternativas, no Brasil o primeiro produto disponível comercialmente foi a ripafolitropina alfa bovina (FSH recombinante bovino; rbFSH), que tem como característica a meia-vida longa, o que já traz uma vantagem sobre o FSH purificado por reduzir o estresse de manejo das doadoras. Em termos de taxa de produção embrionária, o rbFSH já se mostrou efetivo, pois quando aplicado em novilhas Bos taurus, foi capaz de estimular a SOV e obtenção de embriões em número similar, entre animais tratados com pFSH e rbFSH (Carvalho et al., 2014). Porém, o rbFSH disponível comercialmente ainda apresenta custo elevado, determinando a busca por alternativas mais econômicas. Nesse sentido, torna-se importante determinar a viabilidade da recém-lançada molécula de eCG recombinante (reCG), que apresenta custo bem menor que o rbFSH e potencialmente pode induzir a SOV. Estas duas alternativas têm potencial para contornar as limitações observadas na SOV de ovinos, portanto, o objetivo deste trabalho é determinar a viabilidade do uso de moléculas inovadoras na espécie ovina.

Protocolo de sincronização do estro e superovulação:

Para a sincronização do estro e SOV serão utilizados protocolos amplamente utilizados em ovinos e protocolos modificados, os quais correspondem ao objeto de estudo deste projeto. Para isso, serão utilizados DIVs comerciais, específicos para pequenos ruminantes, inseridos com auxílio de aplicadores específicos para este fim. Os aplicadores serão higienizados com água e desinfetados com cloreto de alquil dimetil benzil amônio (CB-30 TA) previamente a utilização em cada animal. As administrações de fármacos intramusculares, serão feitas com agulhas hipodérmicas de calibre 40x8 (21G ½) e seringas estéreis.


Ultrassonografia:
Os exames ultrassonográficos serão realizados pelo método transretal utilizando scanner modo-B transdutor linear de 5 a 7,5MHz, (E2V, SonoScape) e, com adaptador para manejo em pequenos ruminantes (Maggi et al., 2024). Após a remoção das fezes e lubrificação do reto com 10 ml de carboximetilcelulose, será introduzido o transdutor lubrificado e será feita a identificação das estruturas ovarianas. As avalições serão realizadas em animais mantidos em estação, contidos em tronco de contenção específico para a espécie.

Inseminação artificial intrauterina por laparoscopia:

Visando a prevenção de complicações geradas por falsa via aspiratória durante o posicionamento de Trendelenburg, os animais serão submetidos a jejum alimentar prévio de 24 horas (Trimmel et al., 2022) e hídrico de oito horas (Seddighi; Doherty, 2016), a fim de reduzir o conteúdo estomacal. Para o início da intervenção, será realizada sedação leve utilizando formulação comercial de cloridrato de xilazina 2% na dose de 0,05 mg/kg e 0,5 mg/kg de cloridrato de midazolam intramuscular. Em seguida, os animais serão contidos em posição de Trendelenburg em maca específica para laparoscopia em pequenos ruminantes. Após adequado posicionamento, será procedida a antissepsia da região abdominal caudal e a realização de dois botões de anestesia infiltrativa utilizando cloridrato de bupivacaína 0,5% (Cristália), aplicados a aproximadamente 3 cm lateralmente à linha média e a 4 cm cranialmente a glândula mamária. Nos locais de bloqueio anestésico, serão feitas incisões cutâneas de cerca de 0,5 cm com lâmina de bisturi nº 23. Em uma das incisões, será introduzido um trocarte com sua cânula, por meio da qual ocorrerá a insuflação do abdome com CO₂ para formação do pneumoperitônio, possibilitando o acesso e a manipulação do trato reprodutivo. O endoscópio será introduzido por essa mesma cânula para identificação e avaliação das estruturas de interesse. Na segunda incisão, será inserido um novo trocarte com cânula para a introdução do aplicador de sêmen, o qual será utilizado para depositar o sêmen na porção médio-cranial de ambos os cornos uterinos. A deposição será realizada por meio da punção dos cornos com o aplicador, desenvolvido especificamente para essa finalidade, equipado com bainha de inseminação modelo Aspic (IMV). Após a inseminação, todos os instrumentos serão removidos e será desfeito o pneumoperitônio. Por fim, as incisões serão suturadas com pontos isolados simples utilizando fio de nylon 1-0. Os animais receberão analgésico/antinflamatório flunexina meglumina (2mg/kg) e acompanhamento pós-operatório até sete dias da intervenção, quando se procederá a remoção dos pontos.

Coleta de Embriões:
Os animais que apresentarem no mínimo quatro corpos lúteos durante a avaliação ultrassonográfica para determinação de resposta aos tratamentos de SOV, serão considerados aptos para o procedimento de coleta pelo método cirúrgico. Visando a prevenção de complicações geradas por falsa via aspiratória durante o posicionamento de Trendelenburg, os animais serão submetidos a jejum alimentar prévio de 24 horas (Trimmel et al., 2022) e hídrico de oito horas (Seddighi; Doherty, 2016), a fim de reduzir o conteúdo estomacal. Imediatamente antes do início dos procedimentos, as doadoras serão submetidas a tricotomia abdominal visando facilitar a antissepsia do local da incisão, e conjunto com a aplicação de anti-inflamatório analgésico flunixina meglumina (2mg/kg) e dipirona 25mg/kg. Em seguida, com objetivo de evitar hipotensão e depressão respiratória, cada doadora será submetida a um protocolo de anestesia dissociativa obtido pela associação de cloridrato de midazolam (0,5 mg/kg) e cetamina (10 mg/kg) por via intramuscular, caso necessário será realizada nova administração de 1mg/kg de cetamina por via intravenosa, a fim de manter o plano anestésico. Também será fornecido suporte de O2, via máscara facial de tamanho adequado em um fluxo de 12–15 ml/kg/minuto. A seguir, os animais serão contidos em uma maca para laparoscopia em pequenos ruminantes visando manutenção das doadoras em posição de Trendelenburg a fim de obter o deslocamento cranial das vísceras para facilitar a exposição do útero. Após a antissepsia com clorexidina 2% degermante e posicionamento de campos cirúrgicos estéreis, será procedida a anestesia infiltrativa com cloridrato de bupivacaína 0,5% (Cristália), na linha média para realização de uma incisão retroumbilical de 6cm de comprimento. A seguir, o útero será tracionado com uma pinça atraumática até a completa exposição dos cornos uterinos e sua fixação fora da cavidade abdominal. Posteriormente, em cada um dos cornos será realizada uma punção da parede uterina na região medial, no limite do final do ligamento intercornual por onde será introduzida uma sonda pediátrica tipo “Foley” (n° 8 a 10), que terá o seu balão inflado para fixação da sonda evitando refluxo de líquido com embriões para o corpo do útero. Na porção cranial do corno (próximo a junção uterotubárica) será inserida uma sonda uretral (tamanho n° 6), no sentido cranial, por onde passará o meio de lavagem (20 a 60 ml), gerando fluxo de líquido pelo corno capaz de arrastar os embriões passando pela sonda até um tubo de coleta. Durante a realização do procedimento, o útero será constantemente umedecido com solução 0,9% de NaCl. Após a lavagem dos dois cornos uterinos, o órgão será recolocado em sua posição anatômica para então iniciar a síntese das camadas musculares com fio absorvível (poliglactina 910, 1-0) utilizando o padrão de sutura em “X” (Sultan) e síntese de pele com pontos isolados simples utilizando fio de nylon 1-0. O procedimento será finalizado com a execução de curativo das incisões cirúrgicas e aplicação de uma dose de PGF2α (250µg) para lise dos corpos lúteos, prevenindo o estabelecimento de uma gestação no caso de permanência de algum embrião. Os animais receberão acompanhamento pós-operatório diário com remoção dos pontos no décimo dia após a realização do procedimento.

Determinação do nível de alteração na dinâmica folicular de ovelhas tratadas com ripafolitropina alfa bovina (rbFSH; FSH recombinante).
Determinação do nível de alteração na dinâmica folicular de ovelhas tratadas com gonadotrofina coriônica equina recombinante (reCG).
Determinação da quantidade e qualidade de embriões provenientes de ovelhas tratadas com rbFSH ou reCG.
Determinação do nível sérico de progesterona em ovelhas tratadas com rbFSH ou reCG durante o programa de superovulação.