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A molécula QTC-4-MeOBnA tem se mostrado um composto promissor com ação multifuncional no sistema nervoso central. Ensaios in vitro e in silico demonstraram seu potencial inibitório frente a enzimas-chave como glicogênio sintase quinase-3 beta (GSK3β) e AChE, envolvidas em processos de neurodegeneração, estresse oxidativo e disfunções sinápticas (FRONZA et al., 2019; FRONZA et al., 2020a). Estudos in vivo indicam que a molécula QTC-4-MeOBnA exerce efeitos neuroprotetores em camundongos da linhagem Swiss submetidos à indução de déficit cognitivo por escopolamina e estreptozotocina, modelos amplamente utilizados para mimetizar alterações associadas à Doença de Alzheimer, reduzindo o dano oxidativo, modulando marcadores de plasticidade neuronal e influenciando a regulação de vias associadas à apoptose (FRONZA et al., 2020a; FRONZA et al., 2020b).

Esses achados sugerem que os efeitos farmacológicos desta molécula não se restringem a modelos de neurodegeneração, podendo abranger condições associadas ao estresse oxidativo, neuroinflamação e disfunções de neurotransmissão, como ansiedade e depressão. Nesse contexto, modelos como o de EAR apresentam-se como uma lacuna a ser explorada, uma vez que induzem alterações comportamentais e neuroquímicas em camundongos semelhantes àquelas observadas em humanos com ansiedade e depressão (BIRMANN et al., 2021; SOUSA et al., 2018). Avaliar o efeito do QTC-4-MeOBnA nesse modelo constitui um passo importante para compreender seus mecanismos de ação e seu potencial como candidato terapêutico.

O uso de camundongos como modelo experimental é justificado por sua ampla caracterização genética, biológica e comportamental, facilidade de manejo, baixo custo, reprodutibilidade de testes comportamentais e relevância fisiológica para extrapolações clínicas. Essa espécie é amplamente utilizada em protocolos validados para avaliação de fenótipos relacionados à ansiedade e depressão (CRAWLEY; GOODWIN, 1980; STERU et al., 1985), sendo essencial para investigar transtornos multifatoriais que envolvem interações complexas entre processos neuroquímicos, inflamatórios, oxidativos e comportamentais (CRYAN; HOLMES, 2005).

Todos os cálculos referentes ao número de animais seguem rigorosamente os princípios dos 3Rs: Replace, que se refere à substituição sempre que possível por métodos alternativos; Reduction, que garante o uso do número mínimo necessário de animais para a validade estatística dos resultados; e Refinement, que implica o aprimoramento das técnicas utilizadas, de forma a reduzir o sofrimento e maximizar o bem-estar dos animais (RUSSELL et al, 1959; HUBRECHT; CARTER, 2019).

Do ponto de vista científico, ainda que os mecanismos que desencadeiam a ansiedade e a depressão não estejam totalmente esclarecidos, em grande parte por seu caráter heterogêneo (NUTT, 2001), há evidências de que o estresse oxidativo, disfunção do eixo HPA e a neuroinflamação desempenham papéis centrais na patofisiologia de transtornos psiquiátricos (FLANDREU et al., 2012; BOUAYED et al., 2009; PIZZINO et al., 2017; MASOOD et al., 2008). Além disso, evidências indicam que a exposição ao estresse exacerbado pode levar ao surgimento de efeitos deletérios no organismo e desencadear transtornos como a ansiedade e depressão (HERMAN, 1997; COHEN et al., 2007). O desequilíbrio entre a produção de espécies reativas e os sistemas de defesa antioxidante causado pelo estresse, resulta em estresse oxidativo, condição que provoca a peroxidação lipídica, oxidação proteica e disfunção mitocondrial, que por sua vez comprometem a neurotransmissão (glutamatérgica, monoaminérgica e colinérgica), favorecem a ativação microglial e diminuem a produção de proteínas essenciais ao bom funcionamento cerebral, como o BDNF (RAMMAL et al., 2008; KROLOW, 2014; PEÑA-BAUTISTA et al., 2019).

Ademais, alterações na neurotransmissão serotoninérgica desempenham papel fundamental nesses processos, uma vez que a serotonina regula o humor, a resposta ao estresse e a plasticidade neuronal. Disfunções nesse sistema, particularmente nos receptores 5-HT₁A, 5-HT₂A/2C e 5-HT₃, têm sido amplamente relacionadas ao fenótipo tipo ansioso e tipo depressivo (HIGA et al., 2024; VILLAS-BOAS et al., 2021). Assim, avaliar simultaneamente marcadores de estresse oxidativo, componentes do sistema antioxidante e a modulação da via serotoninérgica permite uma abordagem mais integrada, possibilitando esclarecer os mecanismos de ação do QTC-4-MeOBnA, fortalecendo a inferência mecanística nesse estudo.

Assim, o intuito deste projeto é avaliar os mecanismos neuroquímicos pelos quais o composto QTC-4-MeOBnA atua e determinar sua eficácia no tratamento de sintomas do tipo depressivo e tipo ansioso em camundongos machos e fêmeas submetidos ao protocolo de EAR, além de investigar possíveis diferenças entre os sexos. A utilização de modelos animais permitirá analisar, de forma integrada, a atuação da molécula sobre processos oxidativos, inflamatórios, serotoninérgicos e comportamentais, contribuindo para o desenvolvimento de novas abordagens terapêuticas para ansiedade e depressão, transtornos de alta prevalência, grande impacto social e que ainda apresentam limitações significativas nos tratamentos disponíveis (CRYAN; HOLMES, 2005).

Protocolo 1:

Neste protocolo será avaliado o potencial efeito tipo ansiolítico e tipo antidepressivo do QTC-4-MeOBnA em camundongos submetidos a estresse. Para esse experimento serão utilizados camundongos machos e fêmeas da linhagem Swiss (25 -35 g), entre 4 a 6 semanas. No primeiro dia do experimento, os animais serão expostos ao estresse agudo de restrição (EAR), um modelo amplamente utilizado e reconhecido por induzir alterações comportamentais compatíveis com ansiedade e depressão. Durante o procedimento, os animais permanecerão imobilizados em aparato fenestrado por um período de 4 horas, sendo privados de água e alimento, conforme descrito por Sousa e colaboradores (2018). Posteriormente, os animais receberão o composto QTC-4-MeOBnE (1mg/kg, intragástrico (i.g.)) ou óleo de canola (veículo, 10mL/kg, i.g.) ou fluoxetina (controle positivo, 1mg/kg, i.g.) por 3 dias consecutivos (dias 2-4), de acordo com o seu grupo experimental:



Machos:

- Grupo I – Controle: Sem estresse + óleo de canola (10mL/kg, i.g.);

- Grupo II – Per se: Sem estresse + QTC-4-MeOBnE (1mg/kg, i.g.);

- Grupo III – Induzido: EAR + óleo de canola (10mL/kg, i.g.);

- Grupo IV - Tratado: EAR + QTC-4-MeOBnE (1mg/kg, i.g.).

- Grupo V - Controle positivo da depressão e ansiedade: EAR + Fluoxetina (1mg/kg, i.g.).





Fêmeas:

- Grupo I – Controle: Sem estresse + óleo de canola (10mL/kg, i.g.);

- Grupo II – Per se: Sem estresse + QTC-4-MeOBnE (1mg/kg, i.g.);

- Grupo III – Induzido: EAR + óleo de canola (10mL/kg, i.g.);

- Grupo IV - Tratado: EAR + QTC-4-MeOBnE (1mg/kg, i.g.).

- Grupo V - Controle positivo da depressão e ansiedade: EAR + Fluoxetina (1mg/kg, i.g.).



Após a indução e os tratamentos, os animais serão submetidos a uma bateria de testes comportamentais validados (divididos em coortes diferentes de animais conforme descrito no item 14 - Resumo dos procedimentos), incluindo o teste do campo aberto (TCA), o teste do labirinto em cruz elevado (TCE) e claro/escuro (para avaliar parâmetros de ansiedade) e o teste da suspensão da cauda (TSC), teste da borrifagem de sacarose (TBS) e teste da preferência pela sacarose (TPS) (para avaliar parâmetros de depressão).

Ao final dos experimentos, o sangue, tecido cerebral, intestino, glândula adrenal, timo e baço serão coletados para análises e dosagens bioquímicas e moleculares, visando esclarecer os mecanismos neuroquímicos associados aos efeitos da molécula em resposta ao estresse.



Protocolo 2:

Neste protocolo, será investigada a participação do sistema serotoninérgico nos efeitos tipo ansiolítico e tipo antidepressivo do QTC-4-MeOBnA. Para isso, serão utilizados camundongos Swiss machos (25–35 g), com 4 a 6 semanas de idade. Serão conduzidas duas coortes independentes de animais: uma destinada à avaliação do efeito tipo antidepressivo e outra do efeito tipo ansiolítico.

Os animais serão distribuídos em quatro grupos experimentais:



Machos:

- Grupo I – Controle: Veículo dos antagonistas + óleo de canola (10mL/kg, i.g.);

- Grupo II – Per se: Veículo dos antagonistas + QTC-4-MeOBnE (1mg/kg, i.g.);

- Grupo III – Antagonista: WAY100635 ou ketanserina ou ondansetron + óleo de canola (10mL/kg, i.g.);

- Grupo IV – Tratado + Antagonista (WAY100635 ou ketanserina ou ondansetron) + QTC-4-MeOBnE (1mg/kg, i.g.).



Inicialmente, os camundongos serão pré-tratados com antagonistas específicos dos receptores serotoninérgicos, sendo utilizados: WAY-100635 (antagonista seletivo de 5-HT1A; 0,1 mg/kg, via subcutânea (s.c.)), ketanserina (antagonista seletivo de 5-HT2A, e não seletivo de HT2C; 1 mg/kg, via intraperitoneal (i.p.)) ondansetron (antagonista seletivo de 5-HT3; 1 mg/kg, via i.p.), ou do respectivo veículo dos antagonistas.

Após 15 minutos da administração dos antagonistas, os animais receberão o tratamento com QTC-4-MeOBnA (1 mg/kg, i.g.) ou óleo de canola (veículo, 10 mL/kg, i.g.), conforme o grupo experimental. Decorridos 30 minutos da administração do QTC-4-MeOBnA ou veículo, os animais serão submetidos aos testes comportamentais: o TSC (para a coorte destinada à avaliação do efeito tipo antidepressivo) ou o LCE (para a coorte destinada ao efeito tipo ansiolítico).

Espera-se que este estudo contribua para a compreensão dos mecanismos envolvidos nos efeitos tipo ansiolítico e tipo antidepressivo da molécula QTC-4-MeOBnA em modelo animal de estresse, bem como o envolvimento de receptores serotoninérgicos envolvidos nesses efeitos. A investigação proposta poderá demonstrar de que forma o composto atua sobre processos intimamente relacionados à fisiopatologia da ansiedade e da depressão. Ao elucidar esses mecanismos, este estudo pode fornecer subsídios importantes para o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas, potencialmente mais eficazes e com menos efeitos adversos do que os tratamentos atualmente disponíveis.