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A investigação do potencial terapêutico de fitoderivados e metabólitos fúngicos, especialmente os derivados de Sporothrix spp, em associação a modelos alternativos como Caenorhabditis elegans, constitui uma estratégia promissora frente à crescente ameaça dos microrganismos multirresistentes. Essa abordagem permite avaliar simultaneamente a atividade antifúngica e antimicrobiana, a toxicidade e os mecanismos moleculares de defesa e resposta celular, utilizando técnicas como qPCR para genes ligados ao estresse oxidativo, imunidade e metabolismo. Considerando que muitos antibióticos se originam de produtos naturais, a exploração de metabólitos pouco estudados de Sporothrix pode revelar novas substâncias bioativas. Integrando revisão sistemática, ensaios in vitro e análises moleculares em C. elegans, o projeto visa gerar evidências sólidas sobre os efeitos fisiológicos e genéticos desses compostos, contribuindo para o desenvolvimento de alternativas terapêuticas inovadoras e seguras.

Revisão Sistemática
A revisão será conduzida de acordo com as diretrizes do PRISMA Statement (Preferred Reporting Items for Systematic Reviews and Meta-Analyses). A busca será realizada em bases de dados eletrônicas de alto impacto, incluindo PubMed, Scopus, Web of Science e, para incluir a produção científica da América Latina, a base SciELO.
Os descritores de busca serão uma combinação de termos controlados e termos livres para maximizar a sensibilidade da busca: "Sporothrix", "secondary metabolites", "antimicrobial activity", "antibiotic resistance", "bioactive compounds" e "Caenorhabditis elegans". A seleção e extração dos dados serão realizadas de forma independente por dois revisores, e discrepâncias serão resolvidas por um terceiro. Os estudos selecionados deverão abordar metabólitos de Sporothrix ou de fungos com relação filogenética próxima, focando em seu potencial antimicrobiano. As informações extraídas incluirão o tipo de metabólito, as espécies de microrganismos testadas, os métodos de extração e purificação, e os mecanismos de ação propostos.
Ensaios laboratoriais
As cepas de Sporothrix serão cultivadas com o objetivo de maximizar a produção de metabólitos secundários bioativos, utilizando condições nutricionais distintas para modular o perfil metabólico, estratégia coerente com abordagens anteriores que demonstram que diferentes meios influenciam fortemente a biossíntese de compostos bioativos (Ayech et al., 2025). Os cultivos serão realizados em Sabouraud Dextrose Broth, Brain Heart Infusion e meio mínimo sintético. Após o crescimento, o micélio será separado por filtração estéril e o sobrenadante será submetido à extração líquido–líquido utilizando metanol e acetato de etila. Essa abordagem de extração graduada, também recomendada por Waterhouse (2002) para compostos fenólicos e por Sicari et al. (2018) em matrizes orgânicas, aumenta a amplitude dos metabólitos isolados. Os extratos serão concentrados em rotaevaporador e analisados por HPLC e LC-MS, técnicas amplamente empregadas para caracterização química de compostos bioativos, assim como realizado por Josende et al. (2019) para avaliação de moléculas complexas em estudos toxicológicos.
A atividade antimicrobiana será determinada pela técnica de microdiluição em caldo de acordo com as normas CLSI M07-A10, seguindo o padrão adotado na literatura para avaliação de compostos com potencial antibacteriano. Os extratos serão testados contra Staphylococcus aureus (MRSA), Escherichia coli (ESBL), Klebsiella pneumoniae (KPC) e Pseudomonas aeruginosa (MDR), sendo esta última escolhida pela alta relevância clínica e pela sua resistência amplamente documentada (Lau et al., 2014). A Concentração Inibitória Mínima será registrada como a menor concentração sem crescimento bacteriano visível. Ensaios de sinergismo com antibióticos convencionais serão realizados pelo método Checkerboard, metodologia consagrada e recomendada em estudos de interação farmacológica.
Os extratos com maior potencial antimicrobiano serão avaliados em modelo in vivo utilizando Caenorhabditis elegans, mantidos em NGM com E. coli OP50, conforme o protocolo clássico de manutenção descrito por Brenner (1974). A sincronização das populações será realizada por filtração, seguindo o método proposto por Certa (1979), amplamente utilizado para obtenção de estágios larvais homogêneos. Para os ensaios de infecção, vermes sincronizados serão expostos a bactérias multirresistentes e tratados com os metabólitos de Sporothrix, em um ensaio de infecção líquida baseado na adaptação de Manohar et al. (2022), que demonstraram a eficácia desse formato para avaliar terapias antimicrobianas em C. elegans. As placas serão mantidas a 25 °C, e a sobrevivência será monitorada diariamente por até cinco dias, com análise posterior por curvas de Kaplan–Meier, conforme utilizado por Ayech et al. (2025) ao investigar a proteção de C. elegans contra infecções bacterianas.
Além disso, serão avaliados parâmetros fisiológicos dos vermes, como motilidade, reprodução e integridade intestinal, seguindo abordagens usadas em estudos anteriores que investigaram toxicidade e funcionalidade em sistemas modelo (Ayech et al., 2025). Para elucidar possíveis mecanismos moleculares, análises de expressão gênica serão conduzidas por qPCR. A extração de RNA será realizada a partir de pools de vermes expostos, seguida de síntese de cDNA por transcrição reversa. Serão quantificados genes relacionados à imunidade inata (pmk-1, lys-7), ao estresse oxidativo (sod-3, gst-4) e à regulação metabólica (daf-16), normalizados pelos genes act-1 e ama-1, conforme recomendações metodológicas amplamente adotadas em estudos genéticos com C. elegans.
Análise Estatística
Os dados quantitativos obtidos nas diferentes etapas serão submetidos a uma análise estatística robusta para garantir a validade das conclusões. Os dados de expressão gênica e toxicidade serão analisados por ANOVA (Analysis of Variance), seguido por testes post hoc como o Teste de Tukey, para comparações múltiplas. Para dados de sobrevivência, será utilizado o teste de Log-Rank.
Adicionalmente, análises multivariadas, como a Análise de Componentes Principais (PCA) e a análise de clusterização, serão aplicadas para identificar padrões e explorar correlações complexas entre as variáveis (atividade antimicrobiana, toxicidade no C. elegans e a expressão gênica), fornecendo uma visão integrada dos resultados. A significância estatística será estabelecida com um valor de p < 0,05.

Esperamos que o projeto identifique metabólitos secundários produzidos pelo fungo Sporothrix com uma atividade antimicrobiana significativa contra bactérias multirresistentes. Além disso, prevemos que esses compostos demonstrarão baixa toxicidade no modelo de estudo o nematoide C. elegans.
A pesquisa também tem o potencial de mostrar que esses metabólitos modulam positivamente as vias de resposta imune e de estresse oxidativo no hospedeiro. Isso seria evidenciado pela alteração na expressão de genes-chave, como pmk-1, lys-7 e sod-3. A correlação entre os dados microbiológicos e as análises moleculares nos permitirá entender o modo de ação desses compostos.
Este projeto pode expandir o conhecimento sobre a diversidade bioquímica de Sporothrix, revelando novas moléculas de interesse farmacêutico. Metodologicamente, a integração de uma revisão sistemática, ensaios in vivo e análises moleculares fortalecerá as abordagens de pesquisa por novos agentes antimicrobianos. Por fim, esperamos que os dados gerados possam dar suporte a futuros estudos focados na purificação, identificação estrutural e avaliação terapêutica dos metabólitos mais promissores