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A regeneração é um fenômeno amplamente observado no reino animal, embora a extensão dessa capacidade varie significativamente entre as espécies. Invertebrados, como planárias e Hydra, possuem a habilidade de regenerar organismos inteiros (VAN WOLFSWINKEL; WAGNER; REDDIEN, 2014). Entre os vertebrados filogeneticamente mais primitivos, como anfíbios e peixes, a regeneração ocorre de maneira menos abrangente, permitindo a reconstrução de partes consideráveis do corpo, mas não de organismos completos. Anfíbios urodelos, como as salamandras, exibem uma extraordinária capacidade de regeneração. Estes são capazes de reconstruir uma ampla variedade de tecidos e órgãos, incluindo membros, caudas, mandíbulas, medulas espinhais e lentes oculares. De maneira semelhante, os peixes teleósteos, como o zebrafish (Danio rerio), possuem a habilidade de regenerar estruturas como corações, nadadeiras, lentes, retinas e medulas espinhais (ZHAO; QIN; FU, 2016).
No entanto, a evolução dos vertebrados levou à perda dessa capacidade regenerativa em alguns tecidos. Em relação aos mamíferos, lesões graves em tecidos ou órgãos, como corações, membros ou medulas espinhais, não desencadeiam processos regenerativos, mas resultam em cicatrização simples, acompanhada pela formação de cicatriz fibrosa (ZHAO; QIN; FU, 2016). A falta dessa capacidade pode ser atribuída a uma combinação de restrições anatômicas, fisiológicas e moleculares, como a complexidade estrutural dos órgãos dos mamíferos, o perfil de citocinas inflamatórias e a inacessibilidade de informações morfogenéticas (JAŹWIŃSKA; SALLIN, 2016).
Em humanos, a resposta a lesões frequentemente resulta em cicatrização, com regeneração insuficiente, o que pode levar a problemas patológicos graves, como a perda irreversível de membros ou danos permanentes ao coração após um infarto. Em contraste, certos vertebrados não-mamíferos adultos, como zebrafish, tritões e axolotes oferecem modelos in vivo únicos para explorar como tecidos maduros danificados podem alternar naturalmente entre fases de inatividade e regeneração (BORCHARDT; BRAUN, 2007; GODWIN; ROSENTHAL, 2014). Além disso, diversos membros da superfamília de hormônios do fator de transformação do crescimento β (TGF-β), notadamente as activinas e inibinas, têm se destacado por desempenharem funções relevantes nos processos de regeneração tecidual (JAŹWIŃSKA; BADAKOV; KEATING, 2007; SALLUSTIO et al., 2017; WANG et al., 2020). No estudo conduzido por Jaźwińska, Badakov e Keating (2007), foi demonstrado que o gene actβA, responsável pela codificação da subunidade beta da activina, apresentava indução significativa já nas primeiras seis horas após a amputação da nadadeira caudal em zebrafish, especificamente na região adjacente à ferida. Ademais, a inibição desse gene resultou em comprometimento da regeneração, evidenciando seu papel essencial nesse contexto biológico. A medicina regenerativa emerge neste campo buscando reconstituir tecidos, órgãos ou partes do corpo que foram perdidos devido a traumas, doenças ou pelo processo de envelhecimento. Assim, identificar um mecanismo regenerativo conservado poderia abrir caminho para o desenvolvimento de terapias que reativem a capacidade regenerativa adormecida em humanos adultos ou em indivíduos envelhecidos, oferecendo novas possibilidades terapêuticas (IISMAA et al., 2018).

1. Seleção e Alocação dos Animais
1.1 Para o teste de qPCR
Serão utilizados 16 zebrafish adultos, divididos igualmente entre dois grupos experimentais:
● Grupo Controle (n = 8): composto por animais selvagens (não editados geneticamente);
● Grupo Experimental (n = 8): composto por descendentes da linhagem i6, previamente editada via CRISPR no gene inhbaa, caracterizada geneticamente em etapa anterior.
1.2 Para o teste de Alizarin Red S
● Grupo Controle (n = 11): composto por animais selvagens (não editados geneticamente);
● Grupo Experimental (n = 11): composto por descendentes da linhagem i6, previamente editada via CRISPR no gene inhbaa, caracterizada geneticamente em etapa anterior.

Os animais serão previamente aclimatados e mantidos sob condições controladas de temperatura, fotoperíodo e alimentação, em conformidade com as boas práticas de manejo de zebrafish em biotério.
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2. Indução da Regeneração Caudal
Para iniciar o processo regenerativo, será realizado um primeiro corte cirúrgico na nadadeira caudal dos peixes dos dois grupos. O corte é feito com animal anestesiado, usando lâmina de bisturi esterilizada, removendo aproximadamente 50% da extensão distal da nadadeira, respeitando os limites anatômicos estabelecidos por protocolos anteriores ( JAŹWIŃSKA; BADAKOV; KEATING; 2007, GEMBERLING, M. et al. 2013) . Após o corte, os animais se recuperam de anestesia em béquer contendo analgésico, retornando ao sistema de manutenção para recuperação em condições controladas. Ali eles serão monitorados quanto à saúde geral, motricidade e alimentação.
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3. Segundo Corte e Coleta Principal (72h)
Usando da mesma metodologia, três dias (72h) após o primeiro corte, será realizada uma segunda intervenção nos mesmos animais, agora removendo a porção já em regeneração ativa da nadadeira caudal. Este segundo corte é fundamental para capturar a ativação precoce de vias moleculares relacionadas à regeneração, especialmente da via TGF-β.________________________________________
4. Extração de RNA e Análises Moleculares
As amostras coletadas serão submetidas à extração de RNA total utilizando o reagente TRIzol™, método padrão e eficaz para tecidos pequenos como nadadeiras. O RNA obtido será posteriormente utilizado para a síntese de cDNA e análises de expressão gênica por RT-qPCR. As análises moleculares focarão na via TGF-β, investigando a regulação de genes como inhbaa, inhbb, tgfb1a, acvr1ba, smad2, entre outros.
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5. Teste de Alizarin Red S
Neste teste os peixes serão anestesiados com tricaína (MS-222, 150 mg/L), seguido de imersão por 15 minutos em solução de AR-S a 0,01% (pH 7,4). Após esse período, os animais serão fotografados e transferidos para aquário de recuperação com água limpa. Este teste será aplicado nos tempos 24h e 96h, ou seja, 24h depois de cada corte. Não há necessidade de eutanásia para os peixes que são submetidos a este ensaio.

6. Considerações Éticas e Justificativa
Todos os procedimentos foram cuidadosamente planejados para causar o mínimo de dor, estresse e sofrimento possível. O modelo de amputação de nadadeira é considerado de baixo impacto em zebrafish, dada sua alta capacidade regenerativa e rápida recuperação. O número de animais foi estimado com base em cálculos estatísticos, garantindo que nenhum animal seja utilizado em excesso, e que os resultados obtidos tenham validade estatística e biológica. Além disso, o uso da linhagem editada geneticamente — herdada por descendência dos peixes fundadores modificados via CRISPR — permite investigar mecanismos de regeneração sem necessidade de novas edições genéticas ou intervenções adicionais nos animais.

Resultados Esperados
Alterações na expressão gênica: espera-se que peixes da linhagem i6 apresentem modulação diferencial de genes da via TGF-β, indicando interferência da mutação nos mecanismos de regeneração.
Impacto na regeneração tecidual: possíveis diferenças no ritmo ou padrão de regeneração da nadadeira entre grupos editados e controles.
Alterações na mineralização: variações na deposição óssea detectadas pelo teste de Alizarin Red S, sugerindo efeito da mutação em processos estruturais.
Identificação de transcritos aberrantes: confirmação de alterações no gene da inibina em nível de RNA, reforçando o impacto funcional da mutação.
Integração dos dados moleculares e fenotípicos: estabelecimento de uma relação entre expressão gênica, mutação genética e resposta regenerativa.
Contribuição científica: avanço no entendimento dos mecanismos moleculares da regeneração em vertebrados, com potencial aplicação em biotecnologia e medicina regenerativa.