Material e Métodos
Os experimentos serão conduzidos em laboratórios e casa de vegetação pertencentes ao Laboratório de Manejo Integrado de Pragas (LabMIP), do Departamento de Fitossanidade, na Faculdade de Agronomia Eliseu Maciel, e no Laboratório de Zoologia de Invertebrados (LZ-INVERT), do Departamento de
Ecologia, Zoologia e Genética, no Instituto de Biologia, ambos da Universidade Federal de Pelotas (UFPel), Campus Capão do Leão, RS. De maneira geral, os testes quanto à toxicidade aguda dos agrotóxicos serão conduzidos no LabMIP, segundo a metodologia utilizada por Pazini et al. (2019). Os cultivos de milho
serão realizados em casa de vegetação anexa ao LabMIP. Os testes para a avaliação comportamental dos parasitoides serão conduzidos no LZ-INVERT. A seguir serão demonstradas as especificidades metodológicas que serão adotadas para avaliação da toxicidade de inseticidas sobre T. remus.
1. Criação dos insetos
1.1. Criação do hospedeiro Spodoptera frugiperda
Para a multiplicação do hospedeiro natural S. frugiperda proveniente do Laboratório de Biologia de Insetos (Labio-UFPel), as lagartas serão mantidas em dieta natural (milho convencional) e artificial de Greene et al. (1976), sendo esta composta pelos seguintes ingredientes: feijão, gérmen de trigo, proteína de soja,
levedura de cerveja, caseína, ágar, solução vitamínica Vanderzant, formaldeído (40%), ácido sórbico, ácido ascórbico, nipagin (metilparahidroxibenzoato) e tetraciclina. A dieta será vertida em placas de bioensaio com 16 células (5,5 centímetros de comprimento x 4,0 cm de profundidade × 3,0 centímetros de
altura por poço) [(Advento do Brasil, São Paulo, Brasil)], para posterior inoculação das lagartas, onde permanecerão até a fase de pupa, em condições ambientais controladas (25±1 C°; 70±10% UR; fotofase: 14 h). As pupas serão acondicionadas em caixas Gerbox® (12 x 12 x 4 cm), com papel de filtro no fundo para a manutenção da umidade, em câmaras climatizadas tipo B.O.D. (25±1 °C; 70±10% UR; fotofase: 14 h), onde permanecerão até a emergência dos adultos.
Após a emergência, os adultos serão mantidos em gaiolas cilíndricas de PVC (20 cm x 20 cm), revestidas internamente com papel filtro (substrato de oviposição), sendo fechadas na superfície superior com tecido tipo “voile” e alimentadas com solução aquosa de mel a 10%. As posturas serão retiradas do
substrato de oviposição a cada dois dias e acondicionadas em placas de Petri contendo dieta artificial, até a eclosão das lagartas. Para a criação de populações resistentes às proteínas Bt, a metodologia de criação será a mesma utilizada para a população suscetível, exceto a dieta para as lagartas que será ofertada a
partir das respectivas plantas Bt.
1.2. Criação do parasitoide Telenomus remus
Os parasitoides serão criados e multiplicados seguindo metodologia adaptada de Stecca et al. (2016). Em uma sala com ambiente controlado (25±1 C°; 70±10% UR; fotofase: 14 h), os parasitoides serão criados em gaiolas, com cerca de 200 fêmeas/gaiola, confeccionadas com tubos de vidro (30 x 10 cm) fechados em suas extremidades por tampões de cortiça cobertos com tecido preto. Em cada extremidade um pedaço de 5 cm será coberto por fita preta para permitir o mais fácil manuseio dos insetos sem que escapem da gaiola e prover um refúgio a luz. Os parasitoides serão alimentados com um filete de mel em
pedaços de cartolina e a eles serão oferecidos ovos de S. frugiperda diariamente, oriundos da criação citada anteriormente. Serão oferecidos aproximadamente 1000 ovos para cada 40 fêmeas de parasitoides com mais de dois dias de emergência, para garantir que as fêmeas tenham copulado, por um período de
exposição de 6 horas. Parte dos ovos parasitados será destinada a testes de toxicidade e parte formará novas gaiolas para manutenção da criação.
2. Inseticidas
Utilizar-se-ão três formulações comerciais de inseticidas para avaliar a toxicidade aguda sobre T. remus, em condições de laboratório (Tabela 1). Os inseticidas encontram-se registrados para o controle de Spodoptera frugiperda na cultura do milho no Brasil e são amplamente utilizados no manejo desse
inseto (BRASIL, 2022).
3. Cultivares Bt
Utilizar-se-ão duas cultivares de milho Bt, VT PRO™ e Viptera® que serão cultivadas em casa de vegetação em vaso plástico (1 planta/vaso) de 10L contendo terra e substrato vegetal na proporção de 1:1. Os tratos culturais serão adotados de acordo com a recomendação para a cultura. No estágio fenológico
V6, as folhas serão retiradas no terço superior das plantas e oferecidas as lagartas.
4. Bioensaios de toxicidade aguda letal a Telenomus remus
As concentrações de cada inseticida que serão utilizadas nos ensaios serão baseadas no nível de ingrediente ativo indicado no rótulo da embalagem das formulações e serão preparadas em duas fases. A primeira fase consistirá em diluições seriadas (1:10) da concentração de estoque de inseticida (1000
ng ia.cm-2) para obter a faixa de doses causadoras de mortalidade entre 0 a 100%. Na segunda fase, sete a dez concentrações de cada inseticida serão preparadas por diluição sequencial em água destilada para obter as curvas de concentração-resposta e as concentrações letais estimadas (CL50). Água destilada será utilizada no tratamento controle.
4.1. Bioensaios de contato tarsal
O método que utiliza frasco de vidro, inicialmente desenvolvido para avaliar a suscetibilidade de Lygus lineolaris (Palisot de Beauvois) (Hemiptera: Miridae) e E. heros (IRAC, 2014) à inseticidas, utilizado para determinar a toxicidade de inseticidas sobre T. podisi (SNODGRASS, 1996), será empregado em testes de toxicidade aguda letal para T. remus, via contato tarsal, no laboratório (temperatura: 25±1 °C; UR: 70±10%; fotofase: 14: h).
Os tubos de vidro (1,0 cm de diâmetro e 8,0 cm de altura= 25,91 cm2) serão impregnados com 600 μL da solução do inseticida de cada tratamento (concentrações de inseticidas). A secagem da calda será realizada em equipamento com rotação, visando à uniformidade da distribuição do inseticida no tubo. Cada tratamento incluirá cinco repetições, cada uma com cinco casais (machos e fêmeas) de adultos parasitoides com idade ≤48 h.
Os parasitoides serão removidos dos frascos contaminados após quatro horas de exposição e transferidos para outros frascos de vidro (diâmetro de 2,4 cm e altura de 8,0 cm) contendo mel puro como alimento. A mortalidade será determinada em 24 horas após a exposição. Considerar-se-ão mortos os
parasitoides que mostrarem incapacidade de locomoção, mediante estímulo por intermédio de pincel com ponta fina.
5. Bioensaios de toxicidade aguda subletal a Telenomus remus
5.1. Bioensaios de contato tarsal
Os casais de T. remus serão mantidos por 24 h em frascos de vidro (2,4 cm de diâmetro e 8,0 cm de altura) contendo mel puro como alimento para o acasalamento. Posteriormente, fêmeas (acasaladas, alimentadas e sem experiência de forrageamento com o hospedeiro) serão transferidas para frascos de vidro (1,0 cm de diâmetro e 8,0 cm de altura= 25,91 cm2) impregnados com as CL50 dos inseticidas, determinadas com base no item 4.1, ou água destilada (tratamento controle). O delineamento experimental será inteiramente casualizado com cinco repetições com 20 fêmeas cada serão usadas.
Após 4 h de exposição aos inseticidas (CL50), os parasitoides serão removidos dos frascos de vidro e transferidos para outros frascos (2,4 cm de diâmetro e 8,0 cm de altura) contendo mel puro como alimento. Quinze fêmeas sobreviventes, selecionadas aleatoriamente a partir de cada tratamento, serão transferidas para o frasco de vidro do mesmo tamanho que conterá mel puro como alimento e após 24 horas (após a exposição) serão transferidas individualmente para a placa de Petri com massa de ovos (idade <12 h) de S.
frugiperda para avaliação do comportamento de oviposição e parasitismo da geração F0, e emergência e sobrevivência (longevidade) da geração F1.
6. Bioensaio comportamental de oviposição de Telenomus remus
6.1. Sem interferência
Os casais de T. remus serão mantidos por 24 h em frascos de vidro (2,4 cm de diâmetro e 8,0 cm de altura) contendo mel puro como alimento para o acasalamento. Posteriormente, quinze fêmeas (acasaladas, alimentadas e sem experiência de forrageamento com o hospedeiro) serão transferidas individualmente para placas de Petri (60x15mm) com uma massa de ovos (<12 horas e 20 ovos) no centro da placa. A partir desse momento, todos os movimentos da fêmea em relação aos ovos serão registrados através do
Estereomicroscópio Zeiss Discovery V20 e a filmagem terminará assim que a fêmea abandonar a massa de ovos. Com as filmagens prontas, será realizada uma análise detalhada dos movimentos e ações das fêmeas com o objetivo de estabelecer padrões do comportamento de oviposição de T. remus em ovos de
S. frugiperda. Os arquivos de filmagem serão nomeados com o código dos indivíduos e analisados em software de edição de imagem. Os vídeos obtidos em formato .MPEG serão convertidos para o formato .AVI através da plataforma auxiliar online Video Converter do Google para serem analisados no software VirtualDub, o qual só permite arquivos no formato .AVI. Os vídeos serão reduzidos a 10 frames por segundo para facilitar a visualização dos movimentos do inseto. Os frames serão importados para o software ImageJ 1.52, o qual possibilita a análise frame por frame com a marcação do percurso
realizado pela fêmea através do pacote MTrackJ do próprio software.
6.2. Com interferência
A partir do conhecimento dos padrões comportamentais de oviposição das fêmeas de T. remus sem influência dos inseticidas e plantas Bt, serão realizados testes sob influência destes fatores. As fêmeas serão contaminadas com cada inseticida e o comportamento de oviposição será observado em ovos
de S. frugiperda alimentadas com cada cultivar de milho Bt.