Portal InstitucionalUFPEL

A esporotricose felina representa um importante desafio para a saúde pública e veterinária, especialmente em regiões endêmicas como o Brasil. Apesar do papel central dos felinos na cadeia de transmissão e da gravidade clínica que frequentemente apresentam quando infectados pelo fungo, ainda são escassos os estudos que abordam de forma aprofundada a resposta imune humoral nesses animais. Compreender em que estágio da doença ocorre uma produção mais intensa de anticorpos IgG pode contribuir significativamente para o aprimoramento do prognóstico clínico, além de possibilitar intervenções terapêuticas mais direcionadas. Dessa forma, há necessidade de estudos que ampliem o conhecimento sobre a imunopatogênese da esporotricose felina e ofereçam subsídios para práticas clínicas mais eficazes.

Seleção sorológica
Serão utilizadas amostras sorológicas selecionadas de felinos, do banco de soro do Hospital de Clínicas Veterinária da UFPel (HCV), os animais escolhidos apresentam sinais clínicos compatíveis e diagnóstico de esporotricose por cultivo fúngico, e divididos de acordo com o sexo (fêmea, macho). Em relação a apresentação clínica, serão classificados em L1- lesões em apenas um local; L2- lesões em locais não contíguos; L3- lesões em três ou mais locais não contíguos; conforme descrito por Schubach et al. (2004) e Miranda et al. (2013). O estado geral dos animais será avaliado e classificado em: S1- estado geral bom, sem sinais sistêmicos; S2- estado geral regular, com sinais sistêmicos leves; S3- estado geral delicado, com sinais sistêmicos moderados; S4- estado geral crítico, com sinais sistêmicos graves.
Serão utilizados soros de gatos hígidos como controle negativo, sem sinais clínicos ou diagnóstico de qualquer doença, também cedidos pelo Laboratório de patologia clínica do HCV.
Todas as amostras serão provenientes de material residual de exames diagnósticos de rotina, não havendo coleta adicional ou intervenção em animais. O projeto estará dispensado de submissão ao Comitê de Ética, conforme Resolução CNS 510/2016.
Produção de exoantígeno na forma micelial de S. brasiliensis
Será utilizada a cepa LM10 de S. brasiliensis, o isolado clínico foi cedido pelo Laboratório de micologia, localizado no Instituto de Biologia da Universidade Federal de Pelotas (LabMico), que foi cultivado em ágar Sabouraud durante 7 dias em uma temperatura de 20-25°C. A preparação do exoantígeno na forma micelial ocorrerá em caldo Sabouraud dextrose, incubação por 14 dias a 28°C em agitador rotativo a 100rpm. Após esse período de incubação o sobrenadante é filtrado em membrana de acetato de celulose mista de 0,45 μm, dialisados contra água destilada a 4 ° C por 3 dias, concentrados 10 vezes por pervaporação. Em eletroforese em gel de dodecil sulfato de sódio-poliacrilamida corada com prata foi medida a concentração de proteína por ensaio de ligação ao corante em relação a um padrão de albumina.

Eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) e Western blot
A formulação dos géis de corrida e de empilhamento foram realizadas, conforme descrito por Lammli, et al. 1970, em resumo as soluções utilizadas foram água destilada, acrilamida 30%, SDS 10%, APS, Tris 1,5 M (PH8,8), misturadas e adicionadas no aparato, ficando por 30 minutos em estufa a 37ªC, para a realização da solidificação do gel. Posteriormente, o gel de empilhamento foi realizado utilizando soluções semelhantes, somente sendo substituída por Tris 1,0 M (PH 6,8), sendo adicionado o gel e ficando novamente na estufa por 20 minutos, até completa solidificação. Após a solidificação dos géis, foram adicionados o marcador e os sobrenadantes do extrato bruto do isolado micológico, sendo 10 µL de marcador, e os antígenos foram misturados com o tampão na quantidade de 10 µL da amostra e 2,5 µL de tampão. Foi adicionado o tampão de corrida na cuba de eletroforese e iniciado a corrida por 30 minutos, a 80 volts com 200 miliamperes. Logo depois, 1 hora e 30 minutos, 120 volts e 200 miliamperes. Um dos géis foi utilizado para a realização da coloração do SDS-Page. Foram realizadas três lavagens com água destilada e adicionado o corante Comassie Brilhante Blue de micro-ondas, ficando por trinta segundos no micro-ondas e, após, em agitamento para posterior visualização das bandas dos diferentes pesos moleculares.
O antígeno de micélio será avaliado por meio de Western blot que será executado com pool de soros de felinos positivos para esporotricose. Em resumo o micélio será submetido a SDS-PAGE a 12%, passado para uma membrana de nitrocelulose e incubada com um pool de soros felinos positivos para esporotricose (1:500) e anticorpo monoclonal anti-histidina 6x conjugado com peroxidase (1:5000; Sigma Aldrich) (MAIA et al., 2022). IgG anti-gato conjugada com peroxidase será usada como anticorpo secundário.

ELISA indireto
A avaliação das amostras será feita em triplicata. Serão utilizadas placas de microtitulação de poliestireno com 96 poços, a placa é incubada a 4°C por uma noite, com 200 ng de antígeno cru diluídos em tampão de carbonato-bicarbonato 5mM com pH 9,8. Após essa incubação as placas são lavadas 3 vezes com 200 microlitros de PBS-T por poço, adicionado 200 microlitros de leite em pó desnatado a 5% em PBS-T, que serve como solução bloqueadora, incubação a 37°C por 2 horas. Posteriormente é feita lavagem 4 vezes com PBS-T, adicionado soro felino (diluição a definir) com diagnóstico de esporotricose, diluídos em 2,5% de leite em pó desnatado em PBS-T, incubada 1 hora a 37°C. Placas lavadas 3 vezes com PBS-T, adicionado IgG anti-felino conjugado com peroxidase de rábano, diluído 1:5000 em PBS-T, incubado a 37 °C por 1 hora. Por fim, placas serão lavados 5 vezes com PBS-T, incubadas por 15 minutos à temperatura ambiente no escuro com solução que promove reação, será adicionado a placa uma solução contendo 0,004 g de dicloridrato de o-fenilenodiamina em 10 ml de tampão fosfato citrato (pH 4,0) e 15 µl de H2O2 a 30%. Após o tempo de incubação de 15 minutos é colocada na placa uma solução de 50 µl de H2SO4 a 3% por poço, que interrompe a reação, assim é feita a leitura da placa em leitor de ELISA a 492 nm, que mede a absorbância da reação.

Análises estatísticas
As análises estatísticas e os gráficos serão realizadas usando o software GraphPad Prism 10.4.1.

Espera-se que a análise sorológica dos anticorpos IgG, realizada por meio de ensaio ELISA utilizando antígenos de micélio do S. brasiliensis, revele uma correlação estatisticamente significativa entre os títulos de anticorpos e o estadiamento clínico de felinos acometidos por esporotricose. Essa relação poderá indicar que a resposta imune humoral específica, refletida nos níveis de IgG circulante, acompanha a progressão da doença e, portanto, pode ser utilizada como marcador prognóstico.
A confirmação dessa hipótese permitirá propor o uso dos títulos de IgG como ferramenta auxiliar na estratificação de risco clínico e na tomada de decisões terapêuticas. Além disso, os resultados poderão contribuir para o desenvolvimento de protocolos de monitoramento imunológico em felinos infectados, facilitando a identificação de casos com potencial evolução desfavorável e permitindo intervenções mais precoces e direcionadas.
Com base nos dados obtidos, será possível também explorar a variabilidade da resposta imune entre diferentes estágios da doença, avaliando se há perfis sorológicos que se associam a quadros clínicos leves, moderados ou graves. Essa abordagem poderá fundamentar futuras investigações sobre imunopatogenia, resposta vacinal e desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas ou preventivas voltadas ao controle da esporotricose felina.