Portal InstitucionalUFPEL

A leptospirose é uma zoonose de alta relevância epidemiológica, causada por bactérias do gênero Leptospira, que afeta humanos e animais em todo o mundo. Em ambientes urbanos e rurais, especialmente em regiões tropicais e pós-enchentes, a doença representa um risco significativo à saúde única. Os cães atuam como reservatórios importantes na cadeia epidemiológica, podendo eliminar a bactéria pela urina mesmo quando assintomáticos, o que contribui para a contaminação ambiental e a transmissão indireta a humanos. O diagnóstico precoce é essencial para o controle e tratamento da doença, mas os métodos convencionais apresentam limitações críticas. O teste de aglutinação microscópica (MAT), considerado padrão ouro, depende da resposta imunológica do hospedeiro e possui baixa sensibilidade na fase aguda da infecção. Estudos recentes apontam que, em amostras únicas, a sensibilidade pode ser inferior a 15%. O cultivo bacteriano, por sua vez, é demorado e exige condições laboratoriais específicas, podendo levar semanas para confirmação. Técnicas moleculares como PCR e qPCR oferecem maior precisão, mas demandam equipamentos sofisticados e profissionais treinados, o que inviabiliza sua aplicação em clínicas veterinárias e em áreas com infraestrutura limitada. Nesse contexto, a técnica de amplificação isotérmica mediada por alça (LAMP – Loop-mediated Isothermal Amplification) tem se destacado como uma alternativa inovadora e eficaz. A LAMP permite a amplificação do DNA em temperatura constante, utilizando equipamentos simples, e possibilita a visualização dos resultados por turbidez, coloração ou fluorescência, inclusive a olho nu. Estudos recentes demonstram que a LAMP apresenta alta sensibilidade e especificidade para a detecção de Leptospira, sendo especialmente útil em ambientes com poucos recursos. A aplicação da técnica LAMP com genes relacionados com a patogênese e virulências das leptospiras, pode revolucionar o diagnóstico da leptospirose canina, oferecendo uma solução prática, acessível e de baixo custo. Além disso, o desenvolvimento de um protocolo LAMP voltado à medicina veterinária contribui para o fortalecimento da vigilância epidemiológica, a proteção da saúde pública e a formação de recursos humanos capacitados em biotecnologia aplicada.

O projeto será desenvolvido em seis etapas integradas, com foco na triagem de alvos genéticos de virulência, desenvolvimento e otimização da técnica LAMP, validação com amostras previamente coletadas e simulações com diferentes concentrações de Leptospira. Todas as atividades serão realizadas com amostras armazenadas a -20 °C e -70 °C, oriundas de estudos previamente aprovados por comissões de ética animal. Não haverá coleta de novas amostras durante a execução.

-Triagem Genômica e Seleção de Alvos
Será realizada uma triagem genômica abrangente de 6 leptospiras patogênicas. As sequências codificantes serão anotadas utilizando o software Prodigal, agrupadas por similaridade com CD-HIT e analisadas por BLASTn. Serão selecionadas regiões conservadas entre cepas patogênicas e ausentes nas saprofíticas, com base em critérios de similaridade (≥90%) e ausência de alinhamento significativo. Os genes candidatos serão validados por alinhamento múltiplo e análise filogenética.

- Desenho e Otimização de Primers LAMP
A partir dos genes selecionados, serão desenhados primers específicos para a técnica LAMP utilizando o software PrimerExplorer V4. Serão desenvolvidos conjuntos completos de primers externos, internos e de alça ajustados para máxima compatibilidade entre espécies patogênicas e mínima similaridade com cepas saprofíticas. Todos os primers serão testados in silico por BLASTn e adquiridos comercialmente. Para o gene lipL32, serão utilizados primers previamente validados por Hsu et al. (2017), apenas como referência comparativa.

- Preparação de Amostras e Extração de DNA
Na padronização, amostras clínicas previamente coletadas em outros projetos previamente aprovados, as quais estão armazenadas a -20 °C e -70 °C. Também serão preparadas amostras simuladas, utilizando diluições seriadas (10⁷ a 10¹ células/mL) de culturas de Leptospira. O DNA será extraído com kits comerciais ou por método térmico (fervura seguida de centrifugação). Para controle positivo, fragmentos dos genes selecionados serão amplificados, purificados, clonados em vetores plasmidiais e transformados em E. coli, com confirmação por sequenciamento automatizado.

- Reação LAMP e Visualização
A reação LAMP será realizada em volume de 25 µL, contendo DNA polimerase, betaina, MgSO₄, dNTPs e tampão específico. As condições de incubação serão ajustadas entre 60–65 °C por 30–60 minutos, com inativação a 80 °C por 5 minutos. Os produtos serão visualizados por eletroforese em gel de agarose 2% ou poliacrilamida 6%. Também poderão ser utilizados métodos de detecção visual com corantes como HNB, SYBR Green I e calceína com MnCl₂, adicionados antes da incubação para evitar contaminação por abertura de tubos. Em alguns ensaios, os produtos serão digeridos com enzimas de restrição específicas para confirmação dos alvos amplificados.

- Validação Comparativa e Sensibilidade Analítica
Os resultados obtidos com LAMP poderão ser confrontados com PCR convencional, nested-PCR e qPCR, utilizando os mesmos alvos genéticos. Serão aplicados protocolos publicados com ajustes locais, incluindo amplificação de genes adicionais. A sensibilidade analítica será testada com diluições de DNA (10⁶ a 10⁰ cópias/µL) e curvas padrão. A especificidade será avaliada com DNA de cepas saprofíticas e outras bactérias clínicas, como E. coli. Os parâmetros diagnósticos de sensibilidade, especificidade e intervalos de confiança de 95% serão calculados com base na qPCR como teste de referência.

- Treinamento, Inclusão e Disseminação
O projeto contempla ações de capacitação técnica e inclusão. Serão realizadas oficinas práticas para bolsistas e profissionais da área veterinária, abordando biossegurança, preparo de reagentes, execução da técnica LAMP, interpretação de resultados e controle de qualidade. Os encontros serão realizados junto ao projeto de ensino denominado de Sessão científica do GEDTA. O conteúdo será adaptado para promover diversidade e acessibilidade, com materiais visuais, linguagem clara e suporte técnico contínuo. Os resultados serão divulgados em eventos científicos, publicações e redes colaborativas de saúde animal, ampliando o impacto do projeto na formação de recursos humanos e na inovação em diagnóstico veterinário.

Espera-se que este projeto resulte no desenvolvimento de um protocolo molecular baseado na técnica LAMP para o diagnóstico da leptospirose canina, utilizando alvos relacionados à virulência de Leptospira spp. O ensaio deverá apresentar elevada sensibilidade e especificidade, com tempo de execução reduzido e aplicabilidade em ambientes com infraestrutura limitada, como clínicas veterinárias convencionais e hospital veterinário.
A padronização da técnica LAMP com diferentes métodos de visualização e digestão enzimática permitirá sua adaptação a diferentes contextos operacionais, incluindo uso em campo e em laboratórios com recursos limitados. A utilização de amostras previamente coletadas e armazenadas garante a viabilidade imediata do projeto e o cumprimento das exigências éticas, ao mesmo tempo em que permite a validação do protocolo em condições reais de infecção. Os testes com amostras simuladas contendo água e diferentes concentrações de Leptospira ampliarão a aplicabilidade da técnica em cenários de vigilância ambiental e triagem populacional.
Do ponto de vista de formação pessoal, o projeto promoverá a capacitação de bolsistas e profissionais da área veterinária em técnicas de biologia molecular, com foco em inclusão, diversidade e formação técnica. O projeto de ensino e atividades práticas previstas contribuirão para a disseminação do conhecimento.
Espera-se que os resultados obtidos sejam publicados em periódicos científicos, apresentados em eventos técnicos e compartilhados com instituições parceiras, promovendo impacto direto na saúde animal, na saúde única e na formação de recursos humanos. O projeto também poderá servir como base para futuras iniciativas de desenvolvimento tecnológico, extensão universitária e inovação em diagnóstico molecular de zoonoses negligenciadas.