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A cicatrização de feridas crônicas constitui um problema significativo na prática clínica, afetando milhões de pacientes em todo o mundo. Essas lesões estão associadas a altos custos de tratamento, longos períodos de hospitalização e impacto substancial na qualidade de vida, representando um desafio tanto para os pacientes quanto para os sistemas de saúde (MAHMOUDI; GOULD, 2020; SHARMA et al., 2024). O processo de cicatrização ocorre através de uma série de etapas em cascata, que incluem a hemostasia, inflamação, proliferação celular e remodelamento tecidual (WILKINSON; HARDMAN, 2020). Quando alguma dessas etapas é comprometida, o fechamento da lesão torna-se lento ou interrompido, caracterizando o quadro crônico, definido quando uma ferida não apresenta progresso significativo na cicatrização, tipicamente menos de 30% de redução do tamanho nas quatro primeiras semanas (MAHMOUDI; GOULD, 2020).
Essas lesões podem ter origens distintas e manifestar-se de diversas formas, sendo as mais comuns as úlceras de pressão, frequentemente observadas em pacientes acamados ou com mobilidade reduzida; as úlceras diabéticas, que afetam indivíduos com diabetes mellitus e resultam de alterações vasculares e neuropáticas; e as úlceras venosas ou arteriais, relacionadas a quadros de insuficiência venosa crônica ou doença arterial periférica (BOWERS; FRANCO, 2020). Independentemente da etiologia, essas lesões impõem considerável impacto na qualidade de vida dos pacientes, comprometendo a mobilidade, provocando dor crônica e exigindo cuidados prolongados que geram custos significativos aos sistemas de saúde (POWERS et al., 2016).
O tratamento de feridas crônicas envolve a combinação de cuidados gerais com intervenções locais específicas. Entre as estratégias mais utilizadas, estão a limpeza e desbridamento da lesão, controle da infecção, manutenção da umidade e o uso de curativos especializados (BOWERS; FRANCO, 2020; HAN; CEILLEY, 2017). Além disso, novas terapias vêm sendo exploradas, como o uso de fatores de crescimento, enxertos de pele, terapias celulares e biomateriais como hidrogéis, que podem fornecer suporte estrutural e liberar moléculas bioativas de forma controlada (MAMUN et al., 2024). Apesar dessas opções, a eficácia clínica muitas vezes é limitada, especialmente em feridas complexas ou de longa duração, o que evidencia a necessidade contínua de desenvolvimento de novas abordagens terapêuticas direcionadas aos mecanismos celulares e moleculares da cicatrização.
Nesse cenário, as lectinas surgem como candidatas promissoras na criação de novas abordagens terapêuticas para o tratamento de feridas crônicas de pele. Lectinas são um grupo de proteínas ou glicoproteínas de origem não imunológica capazes de reconhecer e se ligar reversivelmente a diferentes carboidratos. Elas podem ser encontradas em praticamente todos os organismos vivos, onde desempenham funções de defesa e sinalização celular (CHETTRI et al., 2021). Devido à diversidade de glicanos que essas proteínas são capazes de reconhecer e à variabilidade estrutural de seus sítios de ligação, lectinas são consideradas um grupo heterogêneo, o que pode refletir na especificidade de seus ligantes e nas funções biológicas apresentadas (OSTERNE; DE SLOOVER; VAN DAMME, 2024).
Estudos anteriores têm demonstrado que diversas lectinas apresentam potencial terapêutico na cicatrização de lesões, atuando de forma integrada em diferentes estágios do processo regenerativo. Essas proteínas são capazes de reconhecer e se ligar especificamente a carboidratos em membranas celulares e na matriz extracelular, modulando eventos biológicos essenciais para a reparação tecidual. Além de participarem na regulação de respostas celulares, como adesão, migração e proliferação, as lectinas também podem influenciar a sinalização molecular associada à resposta inflamatória e ao remodelamento da matriz (DO NASCIMENTO NETO et al., 2021; YU et al., 2022). Nesse contexto, seu papel multifuncional tem despertado crescente interesse científico, consolidando-as como potenciais agentes bioativos no campo da medicina regenerativa.
Apesar do potencial terapêutico, algumas lectinas naturais podem apresentar limitações, como citotoxicidade, mitogenicidade e baixa solubilidade (HULDANI et al., 2022; LLOYD et al., 2022). Nesse contexto, estratégias de engenharia de proteínas vêm sendo aplicadas para otimizar suas propriedades, incluindo alterações no domínio de ligação a carboidratos para modificar ou aumentar a seletividade, modificações de superfície para melhorar a estabilidade em soluções fisiológicas e remoção de regiões associadas a efeitos indesejados (COVÉS-DATSON et al., 2021; HIRABAYASHI; ARAI, 2019; HOMBU; BEATTY; NEELAMEGHAM, 2025). Essas abordagens permitem criar variantes de lectinas com desempenho aprimorado e maior segurança para uso clínico, ampliando seu potencial como agentes bioativos no tratamento de feridas crônicas.
A engenharia de proteínas aplicada a lectinas envolve tanto métodos experimentais quanto abordagens in silico para projetar variantes com características específicas (HOMBU; BEATTY; NEELAMEGHAM, 2025). Utilizando ferramentas computacionais, é possível modelar a estrutura tridimensional da proteína, prever interações com glicanos e identificar regiões responsáveis pela ligação ou estabilidade (MATTOX; BAILEY-KELLOGG, 2021; MODENUTTI et al., 2019). Esses modelos permitem simular substituições de aminoácidos, prever impactos na conformação e avaliar a afinidade por diferentes alvos antes de sintetizar e testar experimentalmente (LUNDSTRØM et al., 2022). Além disso, técnicas de docking molecular, dinâmica molecular e análises de estabilidade termodinâmica podem guiar modificações direcionadas, minimizando etapas experimentais e acelerando o desenvolvimento de lectinas otimizadas para aplicações terapêuticas.
A aplicação de lectinas otimizadas por engenharia de proteínas em sistemas de liberação controlada, como hidrogéis, representa uma estratégia promissora para o tratamento de feridas crônicas. Os hidrogéis proporcionam um ambiente úmido favorável à cicatrização e permitem a incorporação estável de biomoléculas, protegendo-as contra a degradação prematura e possibilitando sua liberação controlada ao longo do tempo (DREISS, 2020). Quando combinados com lectinas modificadas para maior estabilidade, seletividade e biocompatibilidade, esses sistemas podem potencializar a ação terapêutica, promovendo não apenas a regeneração tecidual, mas também a modulação do microambiente da ferida.
Os hidrogéis são redes tridimensionais de polímeros hidrofílicos capazes de absorver e reter grandes quantidades de água, formando uma matriz macia e flexível semelhante ao tecido natural (AHMED, 2015). Essa característica permite que funcionem como curativos interativos, mantendo um ambiente úmido que favorece a migração celular, a formação de tecido de granulação e a re-epitelização (LIANG; HE; GUO, 2021). Além disso, hidrogéis podem ser projetados para liberar de forma controlada agentes bioativos, como antimicrobianos, fatores de crescimento ou proteínas terapêuticas, prolongando sua ação no leito da ferida. Sua biocompatibilidade e possibilidade de modificação estrutural tornam essas formulações ideais para o desenvolvimento de terapias avançadas voltadas à cicatrização de feridas crônicas (QU et al., 2018; ZHOU et al., 2024).
Apesar dos avanços no desenvolvimento de biomateriais e terapias bioativas, ainda existe uma lacuna significativa na oferta de tratamentos capazes de acelerar de forma efetiva a cicatrização de feridas crônicas. A integração de lectinas otimizadas por engenharia de proteínas em hidrogéis representa uma oportunidade promissora para unir propriedades estruturais favoráveis à regeneração tecidual com estímulos bioquímicos direcionados. Este projeto propõe o desenvolvimento e a avaliação de sistemas baseados nessa combinação, buscando oferecer uma solução inovadora, segura e eficaz para melhorar os desfechos clínicos e a qualidade de vida de pacientes acometidos por lesões de difícil cicatrização.

Seleção das lectinas
As sequências das lectinas serão obtidas por meio de uma revisão sistemática da literatura e da prospecção em bases de dados especializadas, como Uniprot e Protein Data Bank, que reúnem informações de sequências primárias e estruturas tridimensionais de proteínas (BERMAN et al., 2000; THE UNIPROT CONSORTIUM, 2023). A busca será direcionada para lectinas de qualquer origem, que apresentem evidências de envolvimento em processos relacionados à cicatrização tecidual. Serão consideradas tanto lectinas isoladas e caracterizadas individualmente quanto aquelas descritas em extratos brutos. As sequências serão exportadas em formato FASTA para análise primária e em formato PDB quando houver disponibilidade de estruturas tridimensionais. Todas as informações coletadas serão organizadas em um banco de dados local e planilhas padronizadas para posterior utilização.
Engenharia de proteínas
Nesta etapa, as sequências serão submetidas a um processo de modificação racional com o objetivo de aumentar sua estabilidade, solubilidade e potencial aplicação do processo de cicatrização. Inicialmente, será realizado o mapeamento dos domínios funcionais das lectinas, com particular interesse nos sítios de reconhecimento de carboidratos, regiões de oligomerização e segmentos mutáveis. A partir dessa análise, serão propostas alterações pontuais para reforçar contatos estruturais, reduzir regiões propensas à agregação e otimizar propriedades físico-químicas relevantes para expressão.
Além disso, planeja-se inserir módulos funcionais, como epítopos de ligação ao colágeno ou peptídeos adjuvantes, unidos por meio de linkers, de forma a preservar a conformação e aumentar as funções biológicas da proteína. As variantes projetadas serão avaliadas por diferentes abordagens de modelagem estrutural e análises in silico. Estruturas tridimensionais serão preditas ou refinadas, seguidas de verificações estereoquímicas e cálculos de estabilidade termodinâmica, incluindo estimativas de variação de energia livre associadas às mutações.Simulações de dinâmica molecular em solvente explícito permitirão observar a estabilidade global, a flexibilidade de regiões críticas e o comportamento de junções de fusão. Em paralelo, estudos de docking serão empregados para estimar a afinidade das variantes com ligantes-alvo, incluindo glicanos relevantes e fragmentos de colágeno. Para essas simulações serão utilizados as ferramentas Gromacs 2025.2, AutoDock Tools 1.5.7 e AutoDock Vina 1.1.2 (ABRAHAM et al., 2015; EBERHARDT et al., 2021; MORRIS et al., 2009).
Triagem computacional e priorização de variantes
Após a etapa de modelagem estrutural e predição funcional, as variantes serão submetidas a uma triagem para a avaliação de suas propriedades de desenvoltura (developability), com o objetivo de selecionar apenas aquelas com maior viabilidade para aplicação biotecnológica. Essa análise incluirá o cálculo de parâmetros físico-químicos, como o peso molecular, ponto isoelétrico teórico (pI), índice de instabilidade, potencial de meia-vida em diferentes sistemas de expressão, hidropaticidade média (GRAVY), entre outros (GASTEIGER et al., 2005). As características de antigenicidade e alergenicidade também serão consideradas através das ferramentas Vaxijen 3.0 e AllerCatPro 2.0, com o intuito de identificar e evitar epítopos potencialmente reativos capazes de induzir respostas indesejadas em modelos futuros (DOYTCHINOVA; FLOWER, 2007; NGUYEN et al., 2022). Com base nessas métricas, será elaborado um sistema de ranqueamento que integrará critérios de estabilidade estrutural, solubilidade, afinidade por ligantes, propriedades de desenvoltura e risco imunológico. Apenas as variantes que apresentarem desempenho satisfatório em múltiplos parâmetros serão priorizadas como candidatas, avançando para etapas subsequentes de síntese e validação experimental.
Construção do vetor, expressão e purificação das lectinas recombinantes
As variantes de lectinas selecionadas serão clonadas em vetores de expressão apropriados, priorizando sistemas baseados em Escherichia coli. Para isso, as sequências terão seus códons otimizados e cada construção terá uma cauda de histidina (6xHis Tag) para facilitar a purificação. A expressão das lectinas recombinantes será conduzida utilizando diferentes cepas de E. coli a fim de selecionar a de melhor desempenho para a nossa construção. Condições de indução, como concentração de Isopropil β-D-1-tiogalactopiranosídeo (IPTG), densidade celular e temperatura serão ajustadas para maximizar a solubilidade e o potencial de produção das proteínas. Alternativamente, sistemas de expressão eucarióticos poderão ser utilizados caso sejam necessárias modificações pós-traducionais específicas ou glicosilação funcional das proteínas. Após a expressão, as proteínas serão purificadas utilizando o sistema ÄKTA de cromatografia líquida. As proteínas purificadas serão caracterizadas quanto à integridade e pureza através das técnicas de SDS-PAGE e Western Blot, conforme metodologia proposta por BLANCHER; JONES (2001).
Caracterização estrutural das construções
As lectinas purificadas serão avaliadas quanto à sua estrutura secundária empregando a técnica de dicroísmo circular (DC). Essa análise permitirá verificar se as modificações introduzidas e a incorporação ao hidrogel preservam a conformação correta das proteínas. O DC é amplamente utilizado nas ciências da vida para a caracterização rápida de estruturas secundárias de proteínas, possibilitando identificar alterações conformacionais decorrentes de mutações ou de modificações no ambiente proteico, como variações de temperatura, pH ou força iônica (RODGER; MARSHALL, 2021).
Avaliação da viabilidade celular in vitro
Este ensaio tem como objetivo verificar a citotoxicidade das nossas proteínas engenheiradas em linhagens celulares saudáveis. As células serão cultivadas em Meio Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal bovino, em atmosfera úmida contendo 5% de CO₂ a 37°C. A detecção das células durante a subcultivação será realizada utilizando tripsina-EDTA (0,25%). Para o ensaio de viabilidade celular, as células serão semeadas em placas de 96 poços na densidade de 5.000 células por poço em 100 μL de meio e incubadas por 24 horas para permitir a adesão celular. Em seguida, serão submetidas à diferentes concentrações das proteínas e, após o período de incubação, o meio será removido e será realizado o ensaio de redução de MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil-2H-tetrazólio) (MOSMANN, 1983).
Avaliação da atividade hemolítica in vitro
A atividade hemolítica das lectinas produzidas será avaliada utilizando hemácias (RBCs) de camundongos, por meio da quantificação da hemoglobina liberada em decorrência da lise das células, seguindo protocolo modificado de WANG et al. (2021). O sangue de camundongos será coletado e centrifugado a 100 × g por 10 minutos para obtenção das hemácias concentradas. Estas serão lavadas três vezes com solução salina tamponada com fosfato (PBS) e ressuspensas para atingir uma concentração final de 10% (v/v). Em seguida, 25 μL da suspensão de hemácias será incubada com 100 μL de cada solução de lectina em PBS. As soluções serão preparadas em diferentes concentrações utilizando o método de diluição seriada, de modo a avaliar a relação dose-resposta. A incubação ocorrerá a 37 °C durante 1 hora.
Após o período de incubação, as soluções serão centrifugadas a 1.200 × g por 5 minutos, e a absorbância do sobrenadante será medida a 450 nm para quantificação da hemoglobina liberada. Hemácias em PBS serão utilizadas como controle negativo, enquanto 1% de Triton X-100 será empregado como controle positivo. Este ensaio será conduzido em conformidade com as diretrizes do Comitê de Ética, obedecendo à Lei no 11.794 de 8 de outubro de 2008, ao Decreto no 6.899 de 15 de julho de 2009, bem como às normas estabelecidas pelo Conselho Nacional de Controle de Experimentação Animal (CONCEA). O protocolo será submetido à aprovação do Comitê de Ética no Uso de Animais (CEUA) da Universidade Federal de Pelotas.
Ensaio de ranhura (Scratch assay)
O ensaio de migração celular será realizado utilizando fibroblastos murinos da linhagem L929 e baseado no protocolo de BALKO et al. (2023), com adaptações. As células serão cultivadas em placas de 24 poços até atingirem confluência próxima de 100%. Para a padronização do ensaio, o meio de cultura será substituído por meio com baixo teor de soro (1–2%) a fim de reduzir a proliferação celular. Em seguida, será produzida uma ranhura linear e uniforme no monolayer celular com o auxílio de uma ponteira estéril de 200 μL, simulando uma lesão. Após a realização da ranhura, os detritos celulares serão removidos por lavagens com PBS estéril, e os poços serão tratados com as formulações experimentais (lectinas) e com os controles experimentais (veículo e meio de cultura). Um controle positivo de migração, utilizando fator de crescimento epidérmico (EGF), também será incluído. As imagens da área da ranhura serão registradas imediatamente após o ensaio (tempo 0 h) e em intervalos posteriores (6, 12, 24 e 48 h), utilizando microscópio invertido acoplado a câmera digital. A quantificação da taxa de fechamento da ranhura será realizada por meio da análise da área livre em cada intervalo de tempo, utilizando o software ImageJ. Os resultados serão expressos como porcentagem de fechamento em relação à área inicial, permitindo a comparação entre tratamentos e controles.
Formulação do Hidrogel
As formulações de hidrogel serão preparadas utilizando diferentes polímeros, incluindo metilcelulose (MC), carboximetilcelulose (CMC) e alginato de sódio (AS), com o objetivo de avaliar suas propriedades físico-químicas e de liberação controlada das lectinas. Para as formulações à base de MC e CMC, o agente gelificante será inicialmente disperso em uma mistura de água e glicerol, aquecida a 80°C para MC e 50°C para CMC, até a completa dissolução. Sob condições ambienta

Os indicadores deste projeto estarão relacionados ao desempenho estrutural e funcional das lectinas engenheiradas, à viabilidade tecnológica das formulações em hidrogel e ao potencial terapêutico observado nos modelos experimentais.
Como indicadores técnico-científicos, serão considerados: (i) número de lectinas identificadas e selecionadas por meio da triagem in silico; (ii) quantidade de variantes projetadas e avaliadas computacionalmente; (iii) parâmetros estruturais e energéticos preditos, incluindo estabilidade termodinâmica, afinidade por ligantes, solubilidade e propriedades de developability; (iv) rendimento de expressão recombinante e grau de pureza das proteínas obtidas; e (v) preservação da estrutura secundária após purificação e incorporação ao hidrogel.
No âmbito biológico e terapêutico, os indicadores incluirão: (i) manutenção de baixa citotoxicidade em ensaios in vitro; (ii) aumento significativo da migração celular no ensaio de ranhura; (iii) perfil adequado de liberação controlada e permeação cutânea no modelo ex vivo; e (iv) redução significativa da área da ferida, maior deposição de matriz extracelular e melhora do remodelamento tecidual no modelo murino de úlcera por pressão.
As metas do projeto consistem em:
Identificar e projetar variantes de lectinas com maior estabilidade, solubilidade e afinidade por componentes da matriz extracelular e mantendo baixa toxicidade


Obter expressão recombinante solúvel com rendimento satisfatório e pureza elevada, garantindo estrutura preservada e desempenho adequado em testes in vitro.


Desenvolver ao menos uma formulação de hidrogel estável, homogênea e capaz de promover liberação controlada das lectinas.


Demonstrar aceleração estatisticamente significativa da cicatrização em comparação aos grupos controle no modelo animal.


Como resultados esperados, projeta-se a identificação e validação de lectinas engenheiradas com propriedades aprimoradas, incorporadas a sistemas de hidrogel com características físico-químicas adequadas para aplicação tópica. Espera-se que as formulações apresentem liberação controlada e permeação cutânea compatível com a proposta terapêutica, promovendo redução da área da ferida, aumento da deposição de matriz extracelular e melhor remodelamento tecidual em modelo murino.
Os impactos esperados incluem a geração de conhecimento inédito sobre a aplicação de lectinas na cicatrização, o desenvolvimento de formulações bioativas inovadoras com potencial terapêutico e possibilidade de proteção intelectual. Em nível social e científico, o projeto poderá contribuir para o desenvolvimento de alternativas de tratamento mais eficazes e acessíveis para feridas crônicas, além de promover a formação de recursos humanos qualificados nas áreas de biotecnologia, engenharia de proteínas e biomateriais