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A genética é um componente relevante no desenvolvimento de atletas de elite, com mais de 200 variantes genéticas associadas ao desempenho físico, sendo algumas dessas variantes diretamente ligadas ao status de atleta de elite (Bray et al., 2009c). Em média, 66% da variação no status atlético pode ser explicada por fatores genéticos, o que destaca a importância da genética na performance esportiva (Semenova, Hall e Ahmetov, 2023a). A identificação de novos polimorfismos genéticos pode proporcionar avanços significativos na compreensão das diferenças individuais no desempenho atlético (Varillas-Delgado et al., 2022).

3. Materiais e métodos
3.1. Delineamento observacional do estudo
O estudo será do tipo observacional, transversal, realizado com jovens atletas que fazem ou fizeram parte do projeto Vem Ser Pelotas. A coleta de dados será realizada durante o ano letivo, em datas e horários previamente acordados. Os atletas serão avaliados individualmente em locais adequados, garantindo a privacidade e o conforto durante a coleta de dados.
3.2. População e amostra
A amostra será composta por jovens atletas de ambos os sexos, com idades entre 12 e 18 anos, que participam ou participaram do projeto Vem Ser Pelotas por pelo menos um ano. A amostragem será por conveniência, considerando a adesão voluntária ao projeto e a disponibilidade para a coleta de amostras biológicas. Como critérios de inclusão os participantes deverão ter participação no projeto Vem Ser Pelotas por pelo menos 1 ano, disponibilidade de dados completos (histórico esportivo e amostras biológicas) e consentimento assinado pelos participantes ou por seus responsáveis legais. Serão desconsiderados aqueles que tiverem histórico de lesões graves que impactem significativamente os resultados de desempenho ou falta de adesão ao protocolo de coleta de dados.
3.3. Coleta de dados
3.3.1. Seleção dos polimorfismos genéticos
Considerou-se a necessidade de incluir variantes genéticas com associação documentada a diferentes manifestações físicas, tais como força, potência muscular, resistência aeróbia e eficiência metabólica, características diretamente relacionadas às exigências das modalidades contempladas no projeto Vem Ser Pelotas (rugby, taekwondo, remo e basquete). Foram selecionados três polimorfismos de interesse: ACTN3 R577X (rs1815739), ACE I/D e PPARGC1A Gly482Ser (rs8192678). A escolha destes polimorfismos baseou-se na sua ampla investigação no contexto da genética esportiva, bem como na possibilidade de genotipagem eficiente por meio da técnica de Tetra-Primer ARMS-PCR.
3.3.2. Coleta de material biológico
Para coleta de material biológico, será utilizado raspagem de células das bochechas com swab bucal. O swab será esfregado no interior da boca e debaixo da língua por cerca de dez segundos. O atrito criado entre o ato de esfregar o cotonete na mucosa da boca faz com que as células penetrem e fiquem presas ao cotonete, por meio da saliva. Após feito a extração das células, elas serão deixadas para secar por cerca de uma hora podendo então ser transportadas a temperatura ambiente (Melo et al., 2010) e armazenado em freezer a temperatura de -20°C.
3.3.3. Extração do DNA genômico
Para extração do DNA genômico o SWAB será colocado em um tubo de reação de 1,5mL (Eppendorf®) chamado de Eppendorf com 300 µl do tampão de lise (TRIS Hcl 1 M pH 8,5; 0,5 EDTA mL pH 8; SDS; NaCL) e 10 µl de proteinase K foi misturado no vortex e ficou incubado a 55°C por 4 horas. Então foi realizado spin e retirado o SWAB (seco). Foi adicionado 100 µl de NaCl e homogeinizado. Após isso amostra ficou no gelo por 5 minutos e centrifugada a 12000 rpm RCF máximo 5 por 3 minutos. O sobrenadante será então transferido para outro eppendorf de 1,5 mL com 300 µl de isopropanol e misturado com a mão vagarosamente. Incubado por 5 minutos e centrifugado a 12000 por 5 minutos. Após isto, o tubo será lavado 1x com etanol 70% (500 µl) e o pellet foi seco. Então será suspenso em 50 µl de tampão T.E. (TRIS Hcl 100mM, pH 7,4; EDTA 0,5 M pH 8).
3.3.4. Tetra-Primer ARMS-PCR
A análise dos polimorfismos genéticos será realizada utilizando a técnica de Tetra-Primer ARMS-PCR (Amplification Refractory Mutation System-PCR). Para cada SNP investigado, serão desenhados quatro primers específicos: dois primers externos, responsáveis pela amplificação de uma sequência controle maior do DNA, e dois primers internos, desenhados para amplificar especificamente os alelos variante e selvagem. Os primers serão desenhados utilizando o software Primer3 e terão sua especificidade confirmada por alinhamento com as sequências de referência disponíveis no banco de dados GenBank. A análise dos primers incluirá a avaliação de possíveis dímeros e estruturas secundárias para garantir a eficiência das reações. As reações de PCR serão realizadas em tubos de 0,2 mL contendo um volume final de 25 µL. Cada reação incluirá 30-50 ng de DNA genômico, previamente extraído de amostras de saliva ou sangue por meio do kit comercial, seguindo as orientações do fabricante. O mix de reação conterá tampão de PCR 1X com MgCl₂ (1,5 mM), os primers externos e internos em concentrações otimizadas (0,2 µM e 0,4 µM, respectivamente), dNTPs (200 µM de cada base), e 0,5 U de Taq DNA Polimerase. Água ultrapura será utilizada para completar o volume final da reação. As amplificações serão conduzidas em um termociclador, programado para realizar uma desnaturação inicial a 95°C por 3 minutos, seguida de 35 ciclos de desnaturação a 95°C por 30 segundos, anelamento a uma temperatura específica para cada SNP (entre 55°C e 65°C) por 30 segundos, e extensão a 72°C por 30 segundos. Uma etapa final de extensão será realizada a 72°C por 5 minutos, garantindo a completa amplificação dos fragmentos. Os produtos amplificados serão analisados por eletroforese em gel de agarose a 2%, preparado com GelRed (ou outro corante intercalante, como brometo de etídio, a 0,5 µg/mL) para visualização das bandas. Os géis serão submetidos a uma tensão de 90-120 volts por 40-60 minutos, utilizando um marcador de peso molecular de 100 pb como referência. As bandas esperadas para cada SNP incluirão fragmentos internos específicos para os alelos variante e selvagem, bem como fragmentos externos, que servirão como controle de amplificação. As imagens dos géis serão capturadas em sistema de documentação digital e analisadas para determinar os genótipos.
3.3.5. Avaliação do histórico esportivo
A classificação do nível de sucesso esportivo dos participantes será realizada com base em um modelo adaptado do "Questionnaire to Establish Rank of Participants" (Manning e Pickup, 1998). Os atletas serão classificados em seis categorias, de acordo com seu nível de envolvimento e sucesso competitivo: (1) sem envolvimento esportivo; (2) prática recreacional sem participação em competições; (3) participação em competições locais; (4) participação em competições regionais; (5) participação em competições nacionais; e (6) representação em competições internacionais.
3.4. Análise estatística
Os dados genéticos e do histórico esportivo serão organizados e analisados utilizando o software estatístico SPSS v.27. As análises incluirão a descrição da prevalência dos polimorfismos genéticos através de frequências absolutas e relativas dos polimorfismos genéticos identificados. Serão realizadas análises de correlação e regressão linear ou logística para investigar as relações entre os polimorfismos genéticos e as variáveis de sucesso esportivo, ajustadas para sexo, idade e IMC. Além disso, a análise de variância (ANOVA) será empregada para comparar as médias das variáveis relacionadas ao sucesso esportivo entre os diferentes genótipos dos polimorfismos genéticos.

Os principais indicadores do estudo serão a taxa de participação dos atletas elegíveis, a frequência dos polimorfismos genéticos analisados (ACTN3 R577X, ACE I/D e PPARGC1A Gly482Ser) e a classificação do nível de sucesso esportivo dos participantes. Como meta, espera-se avaliar e genotipar a maior parte dos atletas vinculados ao projeto Vem Ser Pelotas que atendam aos critérios de inclusão, obtendo dados confiáveis sobre o perfil genético e o histórico esportivo dessa população. Entre os resultados esperados, destaca-se a identificação da prevalência dos polimorfismos investigados e a verificação de possíveis associações entre essas variantes genéticas e os diferentes níveis de desempenho esportivo, contribuindo para o avanço do conhecimento científico sobre genética esportiva e para o desenvolvimento de estratégias de identificação e formação de talentos no esporte.