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A neuroinflamação está fortemente associada a transtornos como depressão e ansiedade (Harsanyi, 2022). Modelos baseados na administração de lipopolissacarídeo (LPS) permitem simular essas condições inflamatórias e investigar possíveis tratamentos (Sabedra, 2019; Birmann, 2022). Nesse cenário, Lactobacillus reuteri tem se destacado por seus efeitos anti-inflamatórios e reguladores do eixo microbiota-intestino-cérebro (Luo, 2023; Ali, 2024). Já o selênio, possui potente ação antioxidante e imunomoduladora (Wu, 2021). Dessa forma, o enriquecimento de L. reuteri com selenito de sódio pode oferecer efeitos sinérgicos na proteção contra alterações comportamentais, hormonais, inflamatórias e oxidativas induzidas pelo LPS (Galano, 2013; Kang, 2020; Wu, 2021). Assim, investigar os efeitos do tratamento com essa associação pode contribuir para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas alternativas e seguras para distúrbios relacionados à neuroinflamação. Além disso, em nosso estudo anterior, foram encontrados resultados promissores na modulação redox, pela redução dos níveis de malondialdeído na técnica de TBARS, aumento da capacidade antioxidante no ensaio FRAP, redução dos níveis de corticosterona. Ainda, nosso tratamento contendo L. reuteri enriquecido com selenito de sódio foi capaz de reduzir o nível de TNF-α, reduziu a expressão de IL-6, NRLP3 e IDO, o que demonstra o seu potencial em modular o estresse oxidativo e a inflamação. Dessa forma, torna-se essencial dar continuidade às investigações a fim de elucidar os mecanismos subjacentes aos efeitos observados e compreender de maneira mais aprofundada a potencial ação protetora do tratamento frente a um modelo de indução de depressão através de neuroinflamação induzida por LPS.

Tratamento com Lactobacillus reuteri enriquecido com selenito de sódio

O tratamento será realizado por via intragástrica com seringa de 1ml, 1 vez ao dia por 14 dias. Os animais receberão uma suspensão de 200µL de PBS contendo 109 UFC de Lactobacillus reuteri enriquecido com 200µg de selenito de sódio por ml do isolado bacteriano.

Neuroinflamção induzida por LPS

Neste projeto, a dose escolhida de LPS é de 0,83 mg/kg. Esta escolha foi baseada em estudos anteriores que demonstraram a capacidade do LPS de induzir o comportamento depressivo em camundongos, nesta dose (Domingues et al., 2018 Birmann, 2022). O LPS será dissolvido em solução salina (0,9%) e injetado intraperitonealmente (i.p.) no animal em um volume de 10 mL/kg.

Testes comportamentais

Campo aberto

Será realizado a fim de descartar qualquer efeito de uma possível limitação locomotora ou exploratória causada pelo tratamento com o composto (Walsh; Cummins, 1976). Os camundongos serão colocados no centro de uma caixa de madeira (30 cm × 30 cm × 15 cm) divididos em nove quadrados de áreas iguais, e durante 4 min, serão avaliadas o número de quadrados cruzados (atividade locomotora) e o número de elevações (atividade exploratória)

Teste de suspensão pela cauda (TSC) modificado

O TSC com algumas modificações (Steru et al., 1985) será realizado para avaliar o comportamento de desespero, sendo este um dos sintomas da depressão. Cada camundongo será suspenso individualmente 50 cm acima do chão com fita adesiva colocada a aproximadamente 1 cm da ponta da cauda. O tempo de imobilidade nesta condição será registrado durante os últimos 4 minutos de uma sessão de 6 minutos, no qual os dois primeiros minutos servirá apenas para habituar o animal. A definição de imobilidade é a ausência de comportamento de fuga apresentado pelo animal.

Teste de nado forçado (TNF) modificado

O teste do nado forçado permite avaliar o comportamento do tipo antidepressivo em animais através da análise do tempo de imobilidade como a ausência de comportamento orientado à fuga. Foi descrito originalmente por Porsolt et al. (1997) e será realizado com algumas modificações (Sabedra et al., 2019). Os animais serão colocados individualmente em um cilindro (10 cm de diâmetro por 25 cm de altura), contendo 19 cm de água a uma temperatura de 25 ± 1 °C. O tempo total do teste é de 6 minutos, porém o tempo de imobilidade será registrado apenas nos últimos 4 minutos, pois os 2 primeiros minutos serão destinados a habituação do animal. Os animais serão considerados imóveis quando permanecerem flutuando imóveis na água ou fizerem movimentos para manter o focinho acima da superfície da água.

Teste do labirinto em cruz elevado (TLCE) modificado

O TLCE será utilizado para avaliar o comportamento do tipo ansioso. O aparato utilizado é um labirinto de madeira em formato de cruz, contendo dois braços abertos (30cm x 5cm), dois braços fechados (30cm x 5cm x 15cm) e o centro (5cm x 5cm) (File and Pellow, 1985). Os parâmetros avaliados são o número de entradas nos braços abertos e o tempo de permanência nos mesmos.

Teste do claro-escuro

O teste do claro-escuro será utilizado para avaliar o comportamento do tipo ansioso. O aparato consiste em uma caixa medindo 46 × 31 × 19 cm, com dois compartimentos interligados: um claro (18 × 31 × 19 cm), iluminado com luz branca intensa, e outro escuro (17 × 31 × 19cm), fechado e com pouca iluminação (Crawley and Goodwin, 1980). Os parâmetros avaliados são o tempo de permanência no compartimento claro, o número de entradas no compartimento claro e o número total de transições entre os compartimentos.

Anestesia, punção cardíaca, eutanásia e coleta de tecidos

A anestesia será realizada por inalação de isoflurano, administrado por exposição dos animais a algodão embebido com o agente em recipiente fechado, até a perda de consciência. A coleta sanguínea será realizada por punção cardíaca, método amplamente estabelecido por permitir a obtenção de amostras de sangue de boa qualidade e em volume adequado. Após confirmação da anestesia, por ausência de reflexo de retirada da pata, os animais serão posicionados em decúbito dorsal e a punção será realizada com agulha de calibre 21 acoplada a seringa de 1 mL, inserida em ângulo de 45° logo abaixo do esterno, ligeiramente lateralizada à direita, em direção ao ventrículo esquerdo. Será coletado aproximadamente 1mL de sangue e transferido para tubos contendo heparina. A eutanásia será confirmada imediatamente após a coleta, por deslocamento cervical. Será coletado o cérebro, para dissecação e isolamento do hipocampo e do córtex pré-frontal, e os segmentos do intestino delgado e grosso, visando análises subsequentes.

Análises bioquímicas

Corticosterona

A determinação dos níveis plasmáticos de corticosterona será realizada por ensaio fluorimétrico, conforme descrito por Zenker e Bernstein (1958). As amostras de plasma diluídas serão extraídas com clorofórmio e tratadas com ácido-etanol sulfúrico. Após remoção do solvente, a fluorescência será medida em 247 nm (excitação) e 540 nm (emissão), com os resultados expressos em ng/mL.

Espécies reativas (ER)

A quantificação dos níveis de espécies reativas será determinada pela oxidação de dicloro-diidro-fluoresceína diacetato (DCHF-DA) para 2’,7’-diclorofluoresceína (DCF) fluorescente através de espectrofluorimetria convencional. Resumidamente, a intensidade da fluorescência de DCF será registrada a 520 nm e excitação em 488 nm em espectrofotômetro. Os valores serão expressos em (Loetchutinat et al., 2005).

Avaliação da peroxidação lipídica por TBARS

Esta técnica baseia-se na avaliação da peroxidação lipídica a partir da formação de malondialdeído (MDA). Resumidamente, uma alíquota do sobrenadante homogeneizado será incubado com 8,1% de dodecilsulfato de sódio (SDS), 0,8% de ácido tiobarbitúrico (TBA) e ácido acético/HCl (pH 3,4) a 95 °C por 2 horas. Os níveis de TBARS serão mensurados por espectrofotometria em um comprimento de onda de 532 nm. Os resultados serão expressos como nmol TBARS/mg de proteína (Ohkawa; Ohishi; Yagi, 1979).

Determinação do Poder Antioxidante Redutor do Ferro (FRAP)

A capacidade antioxidante será avaliada por meio do ensaio FRAP, baseado na redução do Fe³⁺ a Fe²⁺ em meio ácido, formando um complexo colorido detectado a 593 nm (Benzie & Strain, 1996). A solução FRAP será composta por 38 mM de acetato de sódio, 20 mM de FeCl₃ e 10 mM de triazina em HCl 40 mM (10:1:1). Serão adicionados 25 μL de amostra à solução, com incubação a 37 °C por 40 minutos no escuro. A absorbância será então medida em espectrofotômetro.

Análise da Carbonilação proteica

A técnica de carbonilação de proteínas, descrita por Levine et al. (1990), envolverá a reação das proteínas com 2,4-dinitrofenilhidrazina (DNPH) para detectar danos oxidativos. Após a coleta e homogeneização das amostras de tecido, as proteínas serão incubadas com DNPH em solução ácida, formando hidrazonas estáveis. As proteínas serão então desnaturadas com ácido tricloroacético (TCA) e precipitados, seguidos de lavagem para remover excessos de reagentes. O conteúdo de carbonilas será quantificado pela medição da absorbância a 370 nm, que corresponde à absorção dos adutos DNPH-proteína. Os resultados serão expressos em nmol de carbonilas por mg de proteína.

Atividade antioxidante da superóxido dismutase (SOD), catalase (CAT) e glutationa peroxidade (GPx)

A atividade da SOD será determinada segundo a metodologia descrita por Misra e Fridovich (1972), que se baseia na inibição da autooxidação da epinefrina em meio alcalino. A atividade da catalase será determinada conforme descrito por Aebi (1984), com base na decomposição do peróxido de hidrogênio (H₂O₂). E, a atividade da GPx será avaliada conforme o método descrito por Wendel (1981), utilizando o sistema GSH/NADPH/glutationa redutase, por meio da dismutação do H₂O₂ a 340 nm. SOD e CAT serão expressas como unidades da enzima por miligrama de proteína e a GPx será expressa como NADPH/min/mg protein.

Análise histológica

Após a eutanásia, fragmentos do intestino delgado, hipocampo e córtex cerebral serão imediatamente coletados e fixados em solução de formalina tamponada a 10%. Os fragmentos menores serão processados de forma rotineira, incluídos em parafina e cortados em seções de 3–4 µm. As seções serão coradas com hematoxilina-eosina (HE) e analisadas em microscópio óptico. A análise histológica será realizada para avaliar possíveis alterações ou lesões causadas pela indução com LPS nos tecidos e os efeitos protetores do tratamento (Birmann, 2021).

Avaliação da expressão gênica por qRT-PCR

A expressão gênica será avaliada por qRT-PCR a partir de RNA total extraído do córtex pré-frontal, hipocampo e intestino delgado de camundongos. Os primers utilizados serão: interleucina-1β (Il-1β, F: 5′- GC TGA AAG CTC TCC ACC TCA ATG - 3′, R: 5′-TGT CGT TGC TTG GTT CTC CTT G-3′), fator de necrose tumoral-alfa (TNF-α; fwd 5'-CAT CTT CTC AAA ATT CGA GTG ACA A-3′, rev 5'-TGG GAG TAG ACA AGG TAC AAC CC-3′), fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF; fwd 5′-CCA TAA GGA CGC GGA CTT GTA C-3′, rev 5′-AGA CAT GTT TGC GGC ATC CAG G-3′), claudin-3 (Cdl3, F: 5′-GCA CCC ACC AAG ATC CTC TA-3′, R:5′ TCG TCT GTC ACC ATC TGG AA-3′), ocludina (F: 5′- GGA CCC TGA CCA CTA TGA AAC AGA CTA C-3′, R: 5′-ATA GGT GGA TAT TCC CTG ACC CAG TC-3′), receptor toll-like 4 (Tlr4, F: 5′-GCC TTT CAG GGA ATT AAG CTC C-3′, R: 5′-AGA TCA ACC GAT GGA CGT GTA A-3′), zonula occludens-1 (Zo-1, F: 5′- GCA CCA TGC CTA AAG CTG TC-3′, R: 5′-ACT CAA CAC ACC ACC ATT GC-3′), e zonula occludens-2 (Zo-2, F: 5′- GGA GAC CAG ATT CTG AAG GTG AAC ACA C-3′, R: 5′- ACC TTT GGG GAT TTC TAG CAG GTA GAG GAC-3′) (Casaril et al., 2019; Birmann et al., 2023).

Espera-se com este projeto encontrar novas terapias para a depressão e também formar recursos humanos qualificados.