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A utilização de inseminação artificial (IA) em suínos com sêmen criopreservado está
limitada a menos de 1% das inseminações realizadas (Zeng et al., 2014). Desta forma a
utilização da biotécnica de criopreservação de sêmen é de suma importância para o
aprimoramento do melhoramento genético dos animais utilizados comercialmente nos país.
As vantagens da IA pode ser maximizada se os espermatozoides estiverem criopreservados,
já que é a melhor alternativa para a distribuição com longo alcance de materiais genéticos de
alta qualidade (Roca et al., 2006). O sêmen congelado também pode ser usado para
estabelecer bancos de variabilidade genética para a conservação da diversidade genética e até
mesmo como reserva para o abastecimento possíveis surtos de doenças, além de facilitar a
troca de material genético com diversos países (Yoshida, 2000). Durante o processo de
congelamento e descongelamento, a célula espermática é exposta a um estresse osmótico e
térmico que causa danos irreversíveis a estrutura e funcionalidade da membrana espermática,
resultando em baixa viabilidade e baixa capacidade fertilizante (Holt, 2000, Watson, 2000,
Roca et al. 2006 e Hernandez et al., 2007,Fraser et al., 2010; Zeng et al., 2014Yeste, 2015,
2016, Wasilewska e Fraser, 2017).Os espermatozoides suínos são muito sensíveis ao choque
térmico, principalmente quando exposto a temperaturas abaixo 15 ° C (Gilmore et ai. 1996).
A perda da integridade espermática pode estar relacionada com a composição lipídica da
membrana plasmática de espermatozoides, ocorrendo estresse oxidativo e formação de
espécies Reativas de Oxigênio (ROS).

Animais: Neste trabalho serão 60 ejaculados, nas diferentes espécies de interesse comercial . Serão colhidos somente ejaculados que apresentaram, no mínimo,
80% de motilidade espermática e de espermatozoides com morfologia normal. Os ejaculados
serão coletados pelo método da mão enluvada, utilizando frascos aquecidos a 38° C e
cobertos com filtro, a fim de separar a fração gelatinosa do sêmen (Hancock; Hovel, 1959).
Para serem processados, os ejaculados deverão apresentar, após a diluição com BTS,
motilidade espermática igual ou superior a 60% e integridade de membrana por fluorescência
igual ou superior a 70%.
Avaliações espermáticas: serão feitas análises avaliando a funcionalidade
espermática (motilidade), estrutura dos gametas masculinos (membrana, acrossoma,
mitocôndria, fluidez de membrana e DNA) e a bioquímica dos espermatozóides (ROS,
TOSC e Peroxidação lipídica).
A motilidade será avaliada no sêmen in natura, durante o período de resfriamento 120
horas e após o descongelamento, utilizando o equipamento Sperm Vision Auto Morphology.
O descongelamento será feito após a incubação das palhetas em banho-maria a 37°C por 10
min. Para a análise, uma alíquota de 300-mL da amostra de sêmen homogeneizada será
colocada em um tubo de 2 ml. O tubo será mantido em um banho- maria a 37 ° C por 5 min
antes da análise. Uma alíquota de 5µl será colocada em uma lâmina de microscópio préaquecida até 37 ° C e as proporções do total de espermatozoides com motilidade serão
registadas (Schulze et al., 2013).
As análises de DNA, integridade de membrana, integridade de acrossoma, fluidez de
membrana, mitocôndria e espécies reativas de oxigêncio serão realizadas em citometria de
fluxo - Attune® Acoustic Focusing (Life Technologies). Dez mil células espermáticas serão
coletadas por amostra. Para seleção de células será utilizada uma coração utilizando Hoechst.
Os eventos não espermáticos (detritos) serão eliminados com base nos gráficos de dispersão
(Petrunkina et al., 2005; Piehler et al., 2005). A análise de citometria de fluxo será realizada
utilizando Attune® Cytometer Versão 2.1.0 (Life Technologies).
A integridade do DNA do espermatozoide será determinanda utilizando as
propriedades da sonda metacromática Laranja de acridine (2 mg/mL) no ensaio de estrutura
de cromatina espermática (SCSA1) (Evenson et al., 1980).
A integridade de membrana plasmática será analisada pelo processo de
permeabilização pela conjugação do PI (iodeto de propídio - 50μg/ml) e da CFDA
(carboxifluoresceína diacetate - 1μg/ml). Os espermatozoides serão classificados como
viáveis/não lesados (DCF+/IP-) e não viáveis/lesados (DCF+/IP+ / DCF-/IP+). Os dados
serão expressos como a percentagem de espermatozoides em cada categoria (Gillan et al.,
2005; Fernández-Gago et al., 2013).
Fluidez de membrana plasmática para esta avaliação utilizará o corante fluorescente
hidrofóbico, a merocianina 540 (M540) que liga-se preferencialmente as membranas com
lipídios frouxamente ligados, devido ao aumento da permeabilidade da membrana plasmática.
As células serão classificadas em alta fluorescência (alta fluidez) e baixa fluorescência (baixa
fluidez). Os dados serão expressos como a percentagem de espermatozoides em cada
categoria (Fernández-Gago et al., 2013).
A integridade do acrossoma será estimada utilizando o lectina PNA combinado com
FITC (Petrunkina et al., 2005). Os espermatozoides serão classificados como: células com
acrossoma não reagido (PNA-/IP-) e células com acrossoma reagido (PNA+/IP-; PNA-/IP+ e
PNA+/IP+). Os dados serão expressos como a porcentagem de espermatozoides em cada
categoria.
Função mitocondrial de espermatozoides será avaliada usando Rodamina 123. Este
corante é facilmente sequestrado nas mitocôndrias e emite fluorescência verde intenso na
mitocôndria ativa (elevado potencial de membrana mitocondrial) (Gillan et al., 2005).
Produção de Espécies Reativas de Oxigênio Intracelular (ERO) esta avaliação ocorrerá
através do 2’7’ Diacetato de Diclorofluoresceína (H2DCFDA), sendo este utilizado para a
detecção de intracelular ERO. H2DCFDA é oxidado para diclorofluoresceína (DCF), que
emite fluorescência a 530 nm, em resposta excitação de 488 – nm (Domínguez-Rebolledo et
al., 2011).

O presente projeto tem como principal finalidade contribuir no processo de criopreservação de células espermáticas de suínos, a fim de possibilitar a utilizar desta Biotécnica nas granjas comercias de suínos. Com a difusão de conhecimento sobre melhores protocolos também se busca a maior inserção do grupo de Pesquisa Reprodução Animal Comparada - RAC da UFPel na comunidade internacional de criobiologia.