Nome do Projeto
Resposta tecidual à extrusão de debris dentinários e irrigantes
Ênfase
Pesquisa
Data inicial - Data final
02/01/2020 - 30/12/2022
Unidade de Origem
Coordenador Atual
Área CNPq
Ciências da Saúde
Resumo
Apesar do grande número de estudos quantificando a extrusão de debris e soluções irrigadoras nas diferentes técnicas de instrumentação dos canais radiculares, ainda são escassos as informações referentes à reação histológica desta extrusão, o que pode dificultar uma melhor compreensão dos fatores que afetam a cicatrização do tecido ósseo após o tratamento do canal radicular. Assim, este projeto tem como objetivo avaliar histologicamente a resposta tecidual à debris de dentina e soluções irrigadoras em ratos Wistar. Serão realizados dois estudos, sendo que no primeiro experimento, lesões periapicais serão induzidas bilateralmente nos primeiros molares inferiores de 36 ratos Wistar (n = 6 por período), por meio da exposição pulpar ao ambiente oral durante 3 semanas. O tratamento endodôntico será realizado no canal mesial destes molares do lado direito, os quais aleatoriamente serão divididos em três grupos experimentais. Nos grupos I e II, serão extruídos respectivamente, 5 mg de debris de dentina não-infectados e infectados com auxílio de uma lima endodôntica manual tipo K # 20, enquanto no grupo III nenhum extravasamento será realizado. Após o preparo biomecânico os dentes serão selados com cimentos de ionômero de vidro fotoativado. Após os períodos experimentais de 7 e 30 dias, os animais serão eutanasiados e as peças preparadas para análise radiográfica e histológica. Os molares esquerdos não serão tratados, servindo de controle negativo. A presença e severidade da reação inflamatória serão avaliadas. O teste de Mann-Whitney será usado para dados não paramétricos e o teste t de Student para dados paramétricos (P <0,05). No segundo experimento a reação tecidual será avaliada em cavidades confeccionadas em fêmur de ratos. Para isto, serão utilizados 36 animais da espécie Wistar (n = 6 por período), nos quais serão preparadas três cavidades de 2mm de diâmetro na superfície cortical do fêmur. As cavidades serão preenchidas com 20 mg de debris estéreis umedecidos em hipoclorito de sódio a 1%; 2,5%; 5% e clorexidina a 2%. No grupo controle negativo, as cavidades cirúrgicas não serão preenchidas. Ao final dos períodos experimentais de 7, 30 e 60 dias, os animais serão eutanasiados, as amostras serão processadas e analisadas histologicamente. A presença e a severidade da reação inflamatória, bem como a deposição de tecido mineralizado, serão avaliadas. Os dados serão analisados estatisticamente e os efeitos das variáveis dependentes calculados, usando o software SPSS (versão 20.0, SPSS, Inc., Chicago, USA) usando os testes não paramétricos Kruskal Wallis e Mann-Whitney U com correção de Bonferroni a p=0,05.

Objetivo Geral

Avaliar a resposta tecidual diante do extravasamento de debris infectados e debris não-infectados, umedecidos ou não-umedecidos em soluções irrigadoras, em animais da espécie Wistar.

Justificativa

O preparo biomecânico é uma etapa importante do tratamento endodôntico. A eliminação do tecido pulpar, da microbiota, de seus subprodutos e a remoção de debris orgânicos e inorgânicos pelo uso de instrumentos e irrigantes endodônticos são os objetivos dessa importante fase do tratamento (LEONARDI et al., 2007). A extrusão apical é uma ocorrência comum durante essa etapa, de forma que nenhum instrumento ou técnica é capaz de evitar esse evento (TANALP, GÜNGÖR, 2014). Independentemente do sistema utilizado, a instrumentação dos canais radiculares resulta na produção de raspas de dentina como resultado do corte das paredes dentinárias dos canais radiculares (CAPAR et al., 2014; TANALP et al., 2006; OZSU et al., 2014). Além de raspas de dentina, também restos pulpares, micro-organismos e soluções irrigadoras podem extravasar através do forame apical durante a etapa de limpeza e modelagem dos canais radiculares (TANALP et al., 2006).
A extrusão de debris e irrigantes está relacionada ainda a outros vários fatores, incluindo a anatomia apical, tipo, tamanho da agulha de irrigação, a técnica de irrigação, a profundidade de colocação da agulha, o tamanho e conicidade do preparo apical e a técnica de instrumentação (ALTUNDASAR et al., 2011; BÜRKLEIN, BENTEN; BÜRKLEIN, SCHÄFER 2012; GHIVARI et al., 2011; TANALP et al., 2006; TINAZ et al., 2005; SILVA et al., 2016). Como consequência, a extrusão apical de debris e soluções irrigadoras após o preparo do canal radicular poderiam desencadear reações inflamatórias na região periapical e subsequente dor pós-operatória, edema (SIQUEIRA et al., 2003; PARIROKH et al., 2012) e exacerbação, possivelmente retardando ou prejudicando o processo de cicatrização (SIQUEIRA et al., 2003)
Nesse sentido, os sistemas de instrumentação do canal radicular têm sido rotineiramente examinados e classificados por vários estudos de laboratório de acordo com a quantidade de debris e soluções irrigadoras extravasadas durante o preparo dos canais radiculares (TINAZ et al., 2005; COSTA et al., 2017; LABBAF et al., 2017; WESTERN et al., 2017), havendo quantidade relativamente grande de evidências indicando que os sistemas de instrumentação endodôntica, especialmente os mecanizados, criam quantidades variadas de debris extravasados apicalmente (GUTMANN et al., 2009). Atualmente, é possível observarmos na literatura endodôntica um amplo debate em relação à mensuração dos debris e irrigantes extravasados pelas diferentes técnicas de instrumentação e pelos diversos sistemas disponíveis no mercado (TANALP et al., 2006; DE-DEUS et al., 2010; TASDEMIR et al., 2010; BURKLEIN et al., 2012; KOÇAK et al., 2013,2015; BURKLEIN et al., 2013; CAPAR et al., 2014; SURAKANTI et al., 2014; EHSANI et al., 2016). No entanto, um estudo recentemente publicado, realizado em cavidades cirúrgicas confeccionadas em fêmur de ratos, demonstrou que debris infectados podem desencadear parâmetros inflamatórios agudos, especialmente durante os primeiros 7 dias de contato com o tecido, mas que a quantidade de debris extruídos não afeta negativamente a resposta tecidual inflamatória (PAPPEN et al., 2019).
Distintas substâncias químicas têm sido sugeridas como soluções irrigadoras eficientes para a desinfecção de canais radiculares. Dentre elas, o hipoclorito de sódio (NaOCl) vem sendo o mais utilizado no tratamento endodôntico devido à sua efetiva atividade antimicrobiana e capacidade de dissolver tecidos orgânicos (ZEHNDER et al., 2006). As excelentes propriedades do solvente orgânico do NaOCl conferem sua eficácia antimicrobiana como agente irrigante (GORDON et al., 1981).
No entanto, ainda persiste a discordância com relação à concentração ideal de NaOCl a ser utilizada. Embora vários estudos anteriores relatam resultados conflitantes da eficácia comparativa do hipoclorito em diferentes concentrações, estudos mais recentes confirmam a superioridade do hipoclorito de sódio de alta concentração sobre as soluções de 1 e 2 % (MA et al., 2011; WANG et al.; 2012). Além disso, vários autores mostram uma relação diretamente proporcional entre a concentração da solução de hipoclorito de sódio e a velocidade de dissolução, isto é, quanto maior a concentração da solução mais rápida é a dissolução tecidual (GROSSMAN et al., 1941; HAND et al., 1978). Por outro lado, o NaOCl é um potencial irritante dos tecidos periapicais, especialmente em altas concentrações (de SERMENO et al., 2009; GERNHARDT et al., 2004). Assim, outros irrigantes com menor potencial de induzir efeitos colaterais adversos são desejáveis.
O gluconato de clorexidina (CHX) tem sido proposto como um agente de irrigação eficaz, na substituição do NaOCl durante o preparo biomecânico do canal radicular (RINGEL et al., 1982; FERRAZ et al., 2001). A CHX também possui excelentes propriedades antissépticas, e sua eficácia no controle químico do biofilme dental em pacientes com doença periodontal já foi comprovada (ADDY et al., 1997; GOTTUMUKKALA et al., 2014; MANTHENA et al., 2015). A principal limitação da CHX como irrigante endodôntico parece ser sua incapacidade de dissolver o biofilme ou matéria orgânica (HAAPASALO et al., 2014; OKINO et al., 2004).
Apesar do grande número de estudos quantificando extrusão de debris e soluções irrigadoras, ainda são escassos os estudos histológicos nesse campo, o que pode dificultar uma melhor compreensão dos fatores que afetam a cicatrização do tecido ósseo após o tratamento do canal radicular. Assim, este estudo tem como objetivo avaliar histologicamente a resposta tecidual diante a inserção de debris de dentina infectadas ou não-infectadas, umedecidas e não-umedecidas com soluções irrigantes em ratos Wistar.

Metodologia

Metodologia 1 - extravasamento em canais radiculares
Estudo laboratorial in vivo, utilizando ratos da espécie Wistar.
Os debris de dentina serão obtidos com o desgaste da porção interna da câmara pulpar de dentes extraídos, com uma broca esférica Nº 6, acionada em micromotor de baixa rotação, sob irrigação.
As raspas de dentina serão mantidas em suspensão com BHI e, conforme o grupo experimental, serão autoclavadas (debris não contaminados), ou infectadas (debris contaminados).
A placa subgengival será coletada de um doador adulto, saudável e suspensa em caldo brain-heart infusion (BHI; Becton Dickinson, Sparks, MD, USA). As raspas de dentina serão incubadas nesta suspensão em placas de 24 poços sob condições de anaerobiose (AnaeroGen; OXOID, Hampshire, UK) a 37°C, por uma semana.
Para realização desse estudo serão utilizados 36 ratos Wistar, machos, com 3 meses de idade (250 a 270 g de peso). Os animais serão alojados em condições controladas padrão (temperatura de 22 ° C ± 1 ° C, umidade de 70%, ciclo de 12 horas/luz-escuridão de 12 horas) e receberão uma dieta de ração padrão com livre acesso à água filtrada. Previamente ao procedimento cirúrgico, os ratos serão anestesiados através de injeção intraperitoneal com Xilazina 10 mg/kg (Ceva Saúde Animal Ltda., Paulínia, SP, Brasil) e Quetamina 80 mg/kg (Vetil Indústria e Comércio Ltda., Louveira, SP, Brasil).
O método para estabelecer comprimento de trabalho (WL) no modelo de rato será com o uso de um localizador apical eletrônico (EAL) (Romiapex a-15 Romidan) (BRANDÃO et al., 2018).
Para induzir lesões periapicais crônicas, o acesso endodôntico e a remoção da polpa serão realizados bilateralmente nos primeiros molares inferiores de 36 ratos. A exposição pulpar será realizada na fossa mesial dos primeiros molares inferiores, utilizando uma broca circular 1011 HL (KG Sorensen, Cotia, SP, Brasil) em alta velocidade, com cerca de 1 mm de profundidade (SCARPARO et al., 2011). O tecido pulpar será removido usando uma lima #K10 (Dentsply / Maillefer, Ballaigues, Suíça) e irrigação abundante com solução a 2,5% de hipoclorito de sódio (NaOCl) (Asfer Indústria Química Ltda., São Caetano do Sul, SP, Brasil). Os dentes serão deixados abertos ao ambiente oral por 3 semanas (SCARPARO et al., 2011).
O tratamento endodôntico será realizado no canal mesial dos primeiros molares inferiores direitos até o CRD (comprimento real do dente), considerando a posição do ápice determinada pela localizador. Devido a limitações anatômicas, o tratamento do canal radicular em ratos só é possível na raiz mesial dos primeiros molares inferiores. Os outros canais radiculares têm uma curva estreita e pronunciada, o que dificulta a preparação do canal. Os animais serão separados em três grupos experimentais (n =12). No primeiro grupo após o tratamento endodôntico serão extruídos respectivamente 5 mg de debris de dentina infectadas, no segundo grupo serão extruídos 5 mg de debris de dentina não-infectadas e no terceiro grupo após o tratamento endodôntico não será extruído qualquer quantidade de debris de dentina (grupo controle positivo). Os primeiros molares inferiores esquerdos não serão tratados e servirão como grupo controle negativo.
O preparo do canal radicular será realizado através da técnica reciprocante. Primeiramente será realizada exploração com uma lima # 15, posteriormente o canal será preparado com uma lima R25 (Lima Reciprocante Reciproc - VDW) no CRD estabelecido pelo localizador.
Os canais radiculares serão irrigados com 2 ml de hipoclorito de sódio a 2,5% (Neo Dental Chemical Products, Tóquio, Japão) usando agulhas de calibre 30 (NaviTip, Ultradent Products, South Jordan, UT), juntamente com aspiração e irrigação final com 5 mL de solução salina estéril.
Em seguida, os canais serão secos usando pontas de papel esterilizadas. Após o preparo do canal radicular, no primeiro e segundo grupos serão extruídos respectivamente, 5 mg de debris de dentina infectados e não-infectados com auxílio de uma lima endodôntica manual tipo K # 20. Os dentes serão selados com cimentos de ionômero de vidro fotoativado (VITRO FIL LC R- NOVA DFL). Após os períodos experimentais de 7 e 30 dias, os animais serão eutanasiados de acordo com seu período experimental. A eutanásia será por inalação de isoflurano. As hemi-mandíbulas serão preparadas para avaliação radiográfica e histológica.
As mandíbulas dos animais serão removidas cirurgicamente e as radiografias periapicais (Rx, Procion) dos primeiros molares serão realizadas, seguindo os princípios da técnica do paralelismo (tempo de exposição: 0,08 s). As imagens serão salvas no formato DICOM para análise. As amostras serão fixadas em solução tamponada a 10% de formalina por 48 h e descalcificadas com EDTA 17% por 4 semanas. Em seguida, as mandíbulas serão processadas para inclusão em parafina em blocos. Cortes seriados (5 μm) serão corados com hematoxilina-eosina e posteriormente analisados em microscopia óptica.
As lâminas serão observadas em microscopia óptica (ampliações de 40x, 100x, 200x, 400x) e as imagens de interesse serão capturadas através de uma câmera digital. Um examinador patologista experiente e cego avaliará todas as amostras de acordo com os escores adaptados de estudos anteriores (Brandão et al., 2018).
Intensidade da inflamação:
(1) ausência de inflamação; (2) infiltrado mononuclear escasso; (3) infiltrado mononuclear e / ou neutrófilos e eosinófilos dispersos; (4) infiltrado polimorfonuclear de neutrófilos e / ou eosinófilos e / ou áreas de formação de abscesso.
Reabsorção radicular:
(1) ausente; (2) reabsorção localizada em um local específico do ápice radicular; (3) reabsorção espalhada em mais de um local do ápice radicular; (4) reabsorção invadindo a dentina.
Neoformação do cemento:
(1) ausência de cemento neoformado; (2) selamento biológico parcial; (3) vedação biológica completa.
As distribuições dos parâmetros radiográficos e histológicos serão analisadas e as estatísticas descritivas (média e desvio padrão) serão calculadas.
O teste de Mann-Whitney será usado para dados não paramétricos e o teste t de Student para dados paramétricos (P <0,05).
Os dados serão analisados no software SPSS (SPSS Statistics for Windows, versão 20.0, SPSS Inc., IBM, Chicago, IL, EUA).

Metodologia – Estudo 2 – Cavidades confeccionadas em fêmur
Para a realização deste estudo serão necessários 36 ratos da espécie Wistar, com média de idade de 4 meses, pesando em média 300g. Os animais serão originários do Biotério da Universidade Federal de Pelotas. Previamente ao procedimento cirúrgico, os ratos serão anestesiados através de injeção intraperitoneal com Xilazina 10 mg/kg (Ceva Saúde Animal Ltda., Paulínia, SP, Brasil) e Quetamina 80 mg/kg (Vetil Indústria e Comércio Ltda., Louveira, SP, Brasil). O fêmur traseiro do lado direito será utilizado para a intervenção. Após a tricotomia e desinfecção da área com solução de álcool iodado, será realizada uma incisão na pele dos animais de 5 cm de comprimento utilizando uma lâmina de bisturi n° 11. Em seguida, os tecidos serão divulsionados e o periósteo será exposto. Em cada animal, três cavidades de 2 mm de diâmetro serão preparadas sobre a superfície cortical do fêmur, com aproximadamente 3 mm de distância umas das outras. Estas cavidades serão realizadas com canetas de baixa rotação com pontas diamantadas n° 5, sob irrigação constante com soro fisiológico, seguido de aspiração. A ponta diamantada será posicionada perpendicularmente ao fêmur até atingir a medula óssea. As cavidades cirúrgicas serão preenchidas com debris de dentina, umidecidos em diferentes soluções irrigadoras. A ferida cirúrgica será suturada com fio de nylon 4-0. Cada animal será individualmente identificado pela cauda ou marcação na orelha e acomodado em ambiente próprio para sua recuperação pós-cirúrgica, sob supervisão de um veterinário. Durante os períodos experimentais, serão mantidos dois ratos por casa, com ciclo de 12 horas dia/noite, temperatura entre 19-23°C, umidade relativa do ar entre 40-70%. A alimentação dos animais, bem como os demais cuidados, seguirá os protocolos regulamentados pelo Biotério da Universidade Federal de Pelotas. A eutanásia dos animais será realizada após os períodos de 7, 30 e 60 dias. Para tal, os animais receberão anestesia com Isoflurano, por via inalatória. Em seguida a perna operada será desarticulada e dissecada para isolar o fêmur e colocada em formol por 24 horas. Após esse período, com um disco de diamante sob baixa rotação, o osso será seccionado transversalmente para separação das cavidades. As cavidades cirúrgicas ficarão submersas em EDTA 17% por um período aproximado de 30 dias. As amostras serão montadas em blocos de parafina e processadas para análise histológica. Secções com espessura de 5 μm serão cortadas transversalmente ao longo do eixo do fêmur, montadas em lâminas e coradas com hematoxilina-eosina (H&E). Os cortes serão analisados com um microscópio óptico (RM2235; Leica, São Paulo, Brazil), usando 40,100, 200, e 400x de magnificação. Após, será realizada a análise histológica por um patologista previamente calibrado.Os eventos celulares inflamatórios serão analisados de acordo com os critérios descritos por Tavares et al., (2013). A ocorrência de infiltrado inflamatório será determinada pela presença de neutrófilos, linfócitos, eosinófilos, macrófagos e células gigantes e classificadas como ausente, rara, moderada ou intensa.
Será avaliada, ainda, a formação de barreira mineralizada, de acordo com os critérios estabelecidos por Assmann et al., (2015), onde a barreira é classificada como: (1) ausente: sem deposição de tecido mineralizado na da abertura da cavidade; (2) parcial: fechamento parcial da cavidade pela deposição de tecido duro; e, (3) completa: fechamento total de cavidade por deposição de tecido.

Indicadores, Metas e Resultados

Hipótese do Estudo 1
A hipótese a ser testada é a de que a presença de debris infectados, provocará maior inflamação periapical do que o extravasamento de debris estéreis, à semelhança do que já foi observado em cavidades cirúrgicas confeccionadas em fêmur de ratos.

Hipótese do Estudo 2
A segunda hipótese a ser testada é a de que a solução irrigadora presente nos debris extravasados não influenciará na reação inflamatória tecidual, sendo o organismo capaz de limitar esse evento e reparar o dano tecidual.

Equipe do Projeto

NomeCH SemanalData inicialData final
ANA PAULA NEUTZLING GOMES1
ANELIZE DE OLIVEIRA CAMPELLO FELIX1
FERNANDA GERALDO PAPPEN2
SAMANTHA RODRIGUES XAVIER

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