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A necrose da polpa dental e, por sua vez, a perda da capacidade de defesa do tecido, propicia a invasão microbiana no sistema de canais radiculares, resultando na formação e no estabelecimento de biofilme intracanal. O biofilme é caracterizado como uma matriz de substância polimérica extracelular aderida a uma superfície sólida. Em comunidade, as bactérias expressam diferentes fenótipos, frequentemente com características diferentes daquelas apresentadas pelas mesmas bactérias no seu estado planctônico. Bactérias organizadas em biofilme são usualmente encontradas em infecções endodônticas persistentes (PILOWNIC, 2017), sendo mais resistentes aos procedimentos de desinfecção, uma vez que se apresentam como uma comunidade altamente organizada e protegida pela matriz extrapolimérica, sendo de difícil desagregação e eliminação (FOUAD, 2011; DEVARAJ, 2016).
Além da organização dos microrganismos em comunidade, a complexidade anatômica do sistema de canais radiculares igualmente pode dificultar a eliminação do biofilme, visto que as bactérias ficam abrigadas em áreas inacessíveis ao preparo biomecânico do canal (FOUAD, 2011; DEVARAJ, 2016). No tratamento de dentes imaturos, os procedimentos para desinfecção são ainda mais críticos, uma vez que as frágeis paredes dentinárias, resultantes da interrupção do processo de dentinogênese em decorrência da necrose pulpar, inviabilizam o preparo mecânico do canal, uma vez que a instrumentação seria responsável pela remoção de tecido mineralizado de uma estrutura já fragilizada (IWAYA, 2001; BANCHS, 2004; TROPE, 2006; BLEICHER, 2013). Nessa condição, portanto, a desinfecção do canal radicular deve ser obtida exclusivamente pelo uso de substâncias químicas com ação antimicrobiana nas fases de irrigação e medicação intracanal.
O controle da infecção intracanal é crucial para o sucesso de Procedimentos Endodônticos Regenerativos (PER) (FOUAD, 2011; VERMA, 2017). Na Terapia Endodôntica Convencional (TEC), a redução da carga microbiana juntamente ao adequado selamento do canal com material obturador são, usualmente, suficientes para o controle da infecção. A ausência de substrato para a manutenção da viabilidade e proliferação desses microrganismos acaba por determinar a sua morte. Entretanto, nos Procedimentos Endodônticos Regenerativos, o selamento apical está ausente, e a comunicação do canal radicular com os tecidos periapicais é imprescindível como fonte de nutrição para o tecido em formação. Por outro lado, esta condição também pode representar o acesso de substrato bacteriano, com potencial insucesso da terapia (FOUAD, 2011; JACOBS, 2017). Assim, a obtenção e manutenção de um ambiente asséptico é essencial para permitir o estabelecimento de um novo tecido no espaço do canal radicular.
Visto o exposto, justifica-se a determinação de um protocolo de desinfecção bastante rigoroso previamente à abordagem regenerativa. No protocolo para PER proposto pela Associação Americana de Endodontistas (AAE) (LAW, 2016), é recomendada a aplicação intracanal de pastas antibióticas ou de hidróxido de cálcio (HC) para desinfecção da dentina radicular, por 1 a 4 semanas.
A pasta de HC é uma medicação amplamente utilizada na endodontia para a desinfecção do sistema de canais radiculares e indução de reparo dos tecidos periapicais (BYSTROM, 1985). Como alternativa a essa medicação, pastas formuladas pela associação de antibióticos também têm sido utilizadas para o controle da infecção na terapia endodôntica. A associação de antibióticos aumenta o espectro de ação da medicação, com potencial melhora no nível de desinfecção do canal. Com esse propósito, a Pasta Triantibiótica (TAP) (KANTAPUTRA, 2014), composta por ciprofloxacina, metronidazol e minociclina, foi proposta como agente antimicrobiano na terapia endodôntica (HOSHINO, 1996). Entretanto, dependendo da concentração de seus componentes, essa medicação pode apresentar efeito citotóxico (RUPAREL, 2012). Além disso, diversos trabalhos têm relatado alteração na cor da coroa dental após o uso da TAP, a qual apresenta em sua composição a minociclina, um antibiótico do grupo das tetraciclinas (KIM, 2010; PETRINO, 2010; DABBAGH, 2012) com reconhecida capacidade de indução de pigmentação dentária. As tetraciclinas agem por quelação do cálcio da dentina, se incorporando ao tecido em mineralização (SANCHEZ, 2014), resultando em alteração de cor e, consequentemente, prejudicando a estética dental (SANTOS, 2017).
Nesse contexto, medicações alternativas à TAP têm sido estudadas, como a Pasta Diantibiótica (GROTTKAU, 2010), formulada apenas com ciprofloxacina e metronidazol, e a Pasta Triantibiótica Modificada (TAPM), na qual a minociclina é substituída por outro antibiótico, como amoxicilina (KAHLER, 2014) ou cefaclor (RUPAREL, 2012; THIBODEAU, 2007). Investigações sobre a citotoxicidade dessas medicações revelaram um efeito concentração-dependente. Uma vez que pastas em concentrações mais elevadas apresentam maior efeito deletério sobre a viabilidade de células-tronco (RUPAREL, 2012; ALTHUMAIRY, 2014) em comparação às pastas em concentrações menores, a AAE (LAW, 2016) tem recomendado a aplicação intracanal de pastas em baixa concentração, de 0,1 a 1mg/mL. Ruparel et al. (RUPAREL, 2012) verificaram em teste de contato direto que a TAP, DAP e TAPM/Cefaclor, na concentração de 1mg/mL, apresentaram desempenho semelhante, com taxa de sobrevivência de células-tronco da papila apical (SCAP) variando entre 33% e 56%, enquanto em concentrações menores (0,1 e 0,01 mg/mL), a taxa de sobrevivência celular foi de 100%. Por sua vez, Althumairy (ALTHUMAIRY, 2014), utilizando discos de dentina tratados com TAP e DAP em diferentes concentrações, verificou que não houve efeito adverso sobre a viabilidade de SCAPs cultivadas sobre os discos medicados com as pastas na concentração de 1 mg/mL, sugerindo que o contato indireto das células com a medicação e a presença da matriz dentinária, podem não influenciar negativamente na sobrevivência celular.
Com o intuito de avaliar o efeito antimicrobiano de pastas antibióticas, diversas metodologias foram utilizadas nos últimos anos. Devaraj et al., (DEVARAJ, 2016) no estudo da influência da TAP e DAP na inibição e desagregação de biofilme de Enterococcus Faecalis, verificaram por análise em microscopia confocal que a proporção de bactérias viáveis e não viáveis após o tratamento com as medicações supracitadas resultou em desempenho semelhante de ambas as pastas. Tanto a TAP quanto a DAP reduziram significativamente a espessura do biofilme e o número de unidades formadoras de colônias (CFU)/mL em comparação com o grupo controle (sem tratamento). Igualmente com o intuito de avaliar o efeito antimicrobiano da DAP, Jacobs et al. (JACOBS, 2017) testaram o potencial dessa medicação nas concentrações de 1 e 5 mg/mL sobre a desagregação de biofilme misto cultivado na superfície de discos de dentina. Por análise em MEV, foi verificado que, em ambas as concentrações, o contato direto da medicação com o biofilme resultou na desagregação do mesmo após 1 semana de tratamento. Todavia, apenas a concentração de 5 mg/mL demonstrou efeito residual da medicação.
A seleção de uma metodologia adequada de avaliação deve ser considerada no estudo do efeito antimicrobiano de materiais e substâncias utilizadas em Odontologia (FOUAD, 2011). Recentemente, a marcação da viabilidade de células bacterianas e a visualização em microscopia confocal de varredura à laser se tornaram métodos amplamente utilizados para mensurar o efeito antimicrobiano de diferentes materiais contra infecções polimicrobianas (PILOWNIC, 2017; YANG, 2016). A utilização de modelos de biofilme multiespécies com predominância de micro-organismos anaeróbios é superior ao emprego de modelos de biofilme com espécie única no que diz respeito à reprodução das condições encontradas na infecção endodôntica (PILOWNIC, 2017). Da mesma forma, metodologias de testes de contato direto não simulam adequadamente as condições clínicas (DEVARAJ, 2016), uma vez que, como já salientado, o biofilme pode estar localizado em áreas do sistema de canais radiculares não acessíveis ao contato direto com as substâncias e materiais antissépticos. O teste de contato direto apresenta, ainda, outras desvantagens: o número de CFU apenas representa bactérias que conseguiram iniciar a divisão celular em uma taxa suficiente para formação de colônias; e aquelas em que os requerimentos para as funções celulares são supridos pelo meio de cultura utilizado.
Nesse contexto, Ma et al. (MA, 2011) desenvolveram um modelo para o estudo da efetividade da desinfecção da dentina por meio do uso de microscopia confocal de varredura à laser. Os autores utilizaram dentes humanos unirradiculares para produção de cilindros de dentina de comprimento padronizado em 4 mm (Fig.1A). Após a ampliação do canal radicular, os espécimes são seccionados, obtendo-se hemi-segmentos, prosseguindo-se com o desgaste da superfície externa para remoção da camada de cemento e exposição dos túbulos dentinários (Fig.1B). Micro-organismos provenientes de biofilme supra e subgengival são inoculados na superfície pulpar e, na sequência, o hemi-segmento inoculado com biofilme é centrifugado para contaminação dos túbulos dentinários em profundidade (Fig.1C). Após diferentes tratamentos, por períodos predeterminados (Fig.1D), a medicação é removida e o hemi-segmento radicular é seccionado (Fig.1E) para avaliação em microscopia confocal de varredura à laser e determinação da taxa de bactérias viáveis e não viáveis. Na atualidade, esse modelo de estudo parece o mais adequado para avaliar o efeito antimicrobiano de materiais utilizados na rotina endodôntica.
A hipótese nula a ser testada é de que não haverá superioridade na desinfecção dentinária promovida pelas pastas de hidróxido de cálcio, triantibiótica, triantibiótica modificada e diantibiótica, quando utilizadas por período de 7, 30 e 60 dias.

Três pastas antibióticas e uma pasta antisséptica à base de hidróxido de cálcio veiculado em meio aquoso, todas com indicação para utilização em endodontia regenerativa, serão testadas. As pastas antibióticas utilizadas serão a TAP (ciprofloxacina, metronidazol e minociclina), a TAPM (ciprofloxacina, metronidazol e amoxicilina) e a DAP (ciprofloxacina e metronidazol), preparadas em suspensão de gel, com proporções iguais de cada um dos antibióticos, nas concentrações finais de 0,1mg/mL e 1mg/mL.

Preparo das amostras

O número de amostras foi determinado a partir de cálculo amostral realizado com o objetivo de detectar uma diferença de até 5% na média dos valores obtidos, em poder de β = 95% e α = 5%. O cálculo indicou uma amostra mínima de 3 espécimes por grupo e período experimental. Seguindo essa indicação, quarenta e um dentes unirradiculares e hígidos serão utilizados no experimento. Após a doação e assinatura do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido pelos pacientes (Apêndice A), os dentes serão lavados com solução fisiológica, desinfetados em solução de hipoclorito de sódio (NaOCl) a 1,5% por 3 minutos, limpos com auxílio de pontas ultrassônicas para remoção dos tecidos periodontais e armazenados em NaOCl a 0,01% até o início do experimento.
A partir desses dentes, serão produzidos segmentos radiculares de 4mm de comprimento, obtidos por secção transversal da raiz 1 mm abaixo da junção cemento-esmalte e por um segundo corte transversal 4mm após o primeiro. As secções serão realizadas utilizando um disco diamantado de 0,6 mm de espessura (ISOMET 5000; Buehler Ltd, Lake Bluff, IL), sob velocidade de 1000 rpm e constante refrigeração. O canal do segmento radicular será alargado com brocas de Gates-Glidden de calibre #6 (equivalente a 1,5 mm de diâmetro) (Tulsa Dentsply, Tulsa, OK), sob velocidade de 300 rpm e refrigeração. Em cada segmento radicular serão produzidas pequenas ranhuras bilaterais na superfície externa do espécime, utilizando uma broca esférica de pequeno diâmetro acoplada em peça de mão acionada em baixa velocidade (Tulsa Dentsply). Na sequência, os segmentos radiculares serão fraturados com cinzel e martelo de borracha em 2 semicilindros. As superfícies externas dos 82 semicilindros serão aplainadas com discos de lixa de granulação 600, a fim de padronizar a espessura em 2 mm e remover a camada de cemento. A superfície externa será desgastada com uma broca carbide de granulação fina, acoplada em peça de mão, sob velocidade de 300 rpm e refrigeração, de modo a ajustar as dimensões dos blocos de dentina às paredes internas do microtubo, com filtro de porosidade de 45 µm, onde serão inseridos. As dimensões finais dos espécimes serão de aproximadamente 4x4x2 mm (MA, 2011).
A smear layer em ambos os lados dos espécimes será removida por imersão dos blocos em NaOCl 5,25% e ácido cítrico 6% (pH 4,0), por 4 minutos em cada solução, em cuba ultrassônica. Os espécimes serão, a seguir, enxaguados em água destilada estéril por 1 minuto. Cada espécime será inserido em um microtubo com filtro, com a parede pulpar (canal radicular) voltada para cima. Qualquer gap entre os bordos do espécime e a parede do tubo será selado com resina composta cor A2, fotopolimerizada por 20 segundos (MA, 2011).


Infecção da dentina com biofilme misto

Biofilme supra e subgengival será coletado de um doador adulto, saudável, entre 25 e 40 anos de idade. O biofilme será suspenso em ágar brain-heart infusion (BHI) (AKKOUCH, 2013) e incubado sob condições anaeróbicas a 37o C, overnight. As bactérias serão coletadas e suspensas em caldo BHI. A densidade celular será padronizada para uma densidade ótica de 0.05 (150 µL, 405 nm) (YANG, 2016).
Cento e cinquenta microlitros de suspensão de biofilme misto em caldo BHI serão adicionados a cada microtubo, contendo os blocos de dentina. Os tubos serão centrifugados em 1400, 2000, 3600 e 5600 giros, em uma sequência de duas vezes cada, por 5 minutos. Uma nova alíquota de suspensão bacteriana será adicionada a cada centrifugação. A solução que penetrar através da dentina e atingir o fundo do microtubo será descartada. Após a centrifugação, todos os tubos serão incubados em caldo BHI a 37o C, em ar, por 24 horas, para facilitar a recuperação das bactérias.
 

Desinfecção da dentina

Os blocos de dentina serão retirados dos microtubos e a resina circundante será removida. A seguir, os blocos serão enxaguados em água destilada estéril por 1 minuto e secos em ar comprimido. A superfície externa (lado do cemento) será impermeabilizada com esmalte de unha. Os espécimes serão novamente fixados no criotubo, como previamente descrito, e aleatoriamente divididos em 5 grupos: HC, TAP, TAPM, DAB e controle (sem tratamento) (Quadro 1). A superfície pulpar de cada espécime será recoberta com a medicação intracanal, de acordo com o grupo experimental a ser estudado. A superfície externa, previamente impermeabilizada com esmalte, ficará voltada para o fundo do microtubo, preenchido com caldo BHI fresco, o qual será renovado a cada 7 dias. Os espécimes serão colocados em estufa pelos períodos experimentais de 7, 30 e 60 dias (n=3 para cada medicação/concentração/tempo experimental) (Quadro 1).
Após a exposição aos agentes antimicrobianos, os espécimes serão removidos dos microtubos, lavados com água destilada estéril por 1 minuto e fraturados verticalmente no centro do bloco, de modo a produzir dois segmentos com duas novas superfícies expostas, apresentando túbulos dentinários fraturados e visíveis no sentido longitudinal. Desta forma, um total de 164 superfícies serão analisadas em microscópio confocal de varredura a laser para avaliação da viabilidade microbiana.

Teste de viabilidade bacteriana no biofilme

O Kit LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability L-7012 para microscopia e ensaio quantitativo, contendo os 2 componentes corantes (SYTO 9 e propidium iodide na proporção de 1:1), será utilizado, segundo as recomendações do fabricante, para marcação do biofilme. A excitação/emissão máxima desses corantes será de aproximadamente 480/500nm para o corante SYTO 9 e 490/635nm para o propidium iodide. A fluorescência das células coradas será visualizada usando um microscópio CLSM (Nikon Eclipse C1; Nikon Canada, Mississauga, Canada). Dois canais simultâneos de imagem serão usados para exibir a fluorescência verde e vermelha. O SYTO 9 (fluorescência verde) cora as bactérias viáveis, enquanto que as bactérias com comprometimento na membrana são coradas com propidium iodide, produzindo fluorescência vermelha.
As imagens de microscopia confocal a laser de 512×512 pixels serão capturadas usando uma câmera EZ-C1 v. 3.40 e construídas no software 691 (Nikon Corporation, Tokyo, Japan). Cinco scans diferentes, 20 µm de profundidade (0.5 µm step size, 40 slices/stack), de cada amostra serão realizadas para padronizar a área e o volume do biofilme digitalizado. Para cada grupo e período, três espécimes serão utilizados, totalizando 15 mensurações por grupo e período de tempo.
A proporção de células vivas/mortas das superfícies dentinárias será analisada usando o Imaris 7.2 software (Bitplane Inc., St. Paul, USA). A proporção do volume da fluorescência vermelha em relação à fluorescência verde indica a proporção de células mortas.

Análise estatística

As proporções do volume de células mortas após a exposição aos diferentes materiais utilizados para tratamento dos espécimes serão submetidas aos testes ANOVA e Tukey usando o SPSS 17.0 (SPSS Inc., Chicago, USA).

Detectar os níveis de desinfecção dentinária promovida pelas pastas de hidróxido de cálcio, triantibiótica, triantibiótica modificada e diantibiótica, usadas por 7, 30 e 60 dias.