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Durante o processo de odontogênese, interações epitélio-ectomesenquimais desencadeiam mecanismos de proliferação celular, histomorfogênese, citodiferenciação e mineralização tecidual. Nas fases iniciais desse processo, observa-se especialmente uma alta atividade proliferativa das células e a condensação das células do ectomesênquima. Nas fases seguintes, são mais evidentes os eventos de morfogênese e de citodiferenciação (SMITH, 2003; THESLEFF, 2014).
Nesse contexto, interações do epitélio interno do órgão do esmalte com as células ectomesenquimais condensadas na região subjacente ao epitélio, denominada papila dental, resultam na diferenciação odontoblástica das células da papila. Esse mecanismo ocorre uma vez que as células do epitélio enviam sinais, por meio de moléculas bioativas, como o fator de transformação de crescimento (TGF) e a proteína óssea morfogenética (BMP), que interagem com receptores específicos da membrana das células-tronco da papila, desencadeando uma cascata de sinalização intracelular (GALLER et al., 2015). Os sinais intracelulares são transduzidos para o núcleo celular, produzindo efeitos sobre a expressão gênica. O controle transcricional de genes tem efeito em eventos intra e extracelulares. Desse modo, as moléculas bioativas, também denominadas de fatores de crescimento, influenciam eventos como a proliferação, diferenciação e secreção (SMITH, 2003). Assim, as células-tronco da papila dental são induzidas a alterar o seu perfil genotípico e fenotípico, passando a apresentar características morfogênicas e funcionais de odontoblastos (BLEICHER, 2014)
Os odontoblastos são células pós-mitóticas, altamente especializadas, com a função primordial de produção de dentina, para formação do elemento dental (dentina primária) e manutenção do tecido dentinário ao longo da vida do indivíduo (dentina secundária) (BLEICHER, 2014). A produção de dentina requer a secreção e a deposição de uma matriz orgânica, composta por proteínas colágenas e não colágenas. A porção colágena da matriz orgânica é composta especialmente por colágeno Tipo I, enquanto que a porção não-colágena é composta por proteínas como a sialofosfoproteína dentinária (DSPP), que após a sua síntese é clivada em sialoproteína dentinária (DSP) e fosfoproteína dentinária (DPP), proteínas da matriz dentinária 1, 2 e 3 (DMP-1, DMP-2 e DMP-3) e proteínas morfogenéticas. Ademais, a osteopontina, a osteocalcina e a osteonectina, presentes na matriz óssea em grandes quantidades, são encontradas em menores quantidades na matriz dentinária (GALLER et al., 2016; WIDBILLER et al., 2017). As proteínas não-colágenas são cruciais no processo de mineralização do colágeno Tipo I (BLEICHER, 2014), resultando na produção de matriz dentinária mineralizada.
No processo de dentinogênese, os odontoblastos expressam uma grande variedade de moléculas bioativas que são secretadas para o espaço extracelular (GALLER et al., 2016). Em sua forma ativa, tais moléculas possuem um tempo de vida curto. Entretanto, quando liberadas para o meio extracelular são imobilizadas em um estado inativo, permanecendo fossilizadas na matriz dentinária mineralizada. Essas moléculas podem ser reativadas em processos de reparo e regeneração (GALLER et al., 2016; WIDBILLER et al., 2017), desempenhando papel em eventos como migração, proliferação, apoptose ou diferenciação celular (WIDBILLER et al., 2017).
A manutenção funcional do complexo dentina-polpa e, por sua vez, do elemento dentário, tem relação direta com a manutenção da vitalidade do tecido pulpar (SMITH, 2003). A polpa dental é um tecido conjuntivo altamente celularizado, vascularizado e inervado, que apresenta potencial defensivo e regenerativo. Em situações de injúria dental, como em casos de lesões de cárie, os subprodutos liberados pelos micro-organismos condicionam a dentina, expondo a matriz orgânica e liberando fatores de crescimento (BLEICHER, 2014), que são reativados e sinalizam eventos na polpa dental que conduzirão à regeneração tecidual (SMITH, 2003). O processo de regeneração dentino-pulpar ocorre por uma inter-relação complexa entre injúria, defesa e regeneração tecidual (GOLDBERG; SMITH, 2004; SMITH, 2003).
Nas injúrias, por mecanismos de sinalização, os odontoblastos aumentam a taxa de deposição de matriz dentinária, na tentativa de proteger o tecido pulpar do agente agressor. Assim ocorre a deposição de dentina reacional, também denominada de terciária. Entretanto, a não eliminação do agente agressor e o consequente avanço do processo de agressão, pode exceder à capacidade de defesa odontoblastos, resultando em sua morte. Nessa situação, células progenitoras presentes no tecido pulpar, igualmente por sinalização via fatores de crescimento, migram para o sítio da lesão, proliferam e diferenciam em células morfofuncionalmente semelhantes a odontoblastos, recebendo a denominação de odontoblastos-like. (BLEICHER, 2014; GRONTHOS et al., 2002; LESOT et al., 1993; SMITH et al., 1995). A família de fatores de crescimento TGF-β, presentes na matriz dentinária, foi identificada como ”família-chave” (FINKELMAN et al., 1990,) na sinalização da diferenciação odontoblástica (BÈGUE-KIRN, SMITH, RUCH, 1992; RUCH, LESOT, 1995) podendo ter importante papel também durante o reparo tecidual (SMITH, 2003). Da mesma forma, a sinalização de eventos angiogênicos é crucial para o reparo. A formação de uma rede vascular no sítio do reparo é fundamental para fornecimento sanguíneo, proporcionando suprimento nutritivo e transporte de gases e metabólitos, imprescindíveis para as funções das células envolvidas no reparo ou na regeneração tecidual. O fator de crescimento vascular endotelial (VEGF) e o fator de crescimento fibroblástico básico (FGF-2) são considerados os medidores mais importantes da sinalização de eventos angiogênicos (MULLANE et al., 2008; ROBERTS-CLARCK, SMITH, 2000; TELLES et al., 2011).
Além da biodisponibilização de fatores de crescimento em condições patológicas, a liberação dessas moléculas sinalizadoras também pode ocorrer a partir de procedimentos terapêuticos clínicos. Condicionantes dentinários são amplamente utilizados em tratamentos restauradores e endodônticos, com o objetivo de promover adesão superficial entre materiais restauradores e a parede dentinária. Os materiais condicionantes possuem propriedades desmineralizadoras, atuando na liberação de fatores de crescimento solúveis e insolúveis da matriz dentinária, do mesmo modo como agem os ácidos em lesões cariosas (ZHAO et al., 2000). Materiais como o hidróxido de cálcio e o agregado de trióxido mineral (MTA) são comumente aplicados como capeadores pulpares, e embora não sejam agentes ácidos, possuem capacidade de solubilização da matriz dentinária (SMITH et al., 1995) e de liberação de fatores bioativos como o TGF-β, que pode contribuir para o reparo da dentina com tecido reacional (FERRACANE, COOPER, SMITH, 2013; GRAHAM et al., 2006; SMITH, 2003). O condicionamento da superfície dentinária também pode ser feito, a partir de soluções irrigadoras como o agente quelante ácido etilenodiamino tetra-acético (EDTA).
Quelantes são agentes que possuem a capacidade de se ligar e sequestrar íons metálicos de substâncias orgânicas, formando uma estrutura estável denominada quelato (GROSSMANN, 1988). O EDTA é um quelante específico de íons cálcio (LEONARDO, 2005). Na superfície dentinária a quelação ocorre às custas dos íons cálcio presentes no fosfato de cálcio da hidroxiapatita, componente inorgânico da matriz dentinária. As propriedades de desmineralização, alteração na dureza e na permeabilidade da dentina; e de remoção da smear layer promovidas pelo EDTA são bastante consagradas na odontologia (ALVES et al., 2016; HAAPASALO et al., 2010; LOTTANTI et al., 2009; MULLANE et al., 2008). Na Endodontia, a remoção de smear layer, propicia contato direto entre as paredes dentinárias e a medicação intracanal ou material obturador (GALLER et al., 2015; LOTTANTI et al., 2009), favorecendo a desinfecção e o selamento radicular, respectivamente (LOTTANTI et al., 2009). Recentemente, tem sido estudado o papel do EDTA na terapia endodôntica regenerativa e na engenharia de tecido pulpar, atuando como agente condicionante da dentina e na biodisponibilização de fatores de crescimento (SCHMALZ et al., 2017; WIDBILLER, et al., 2017; GALLER, et al., 2015; GALLER et al., 2016; PROMPEECHA, et al., 2018).
Ainda que seja um campo em desenvolvimento, a endodontia regenerativa é considerada uma mudança de paradigma na terapia de dentes imaturos com necrose pulpar (CHUEH; HUANG, 2006; HUANG, 2008; LIN, 2017). Essa terapia celular objetiva restaurar as funções do complexo dentina-polpa (IWAYA et al., 2001), visando a continuidade do desenvolvimento radicular e dos tecidos circundantes (DIOGENES; RUPAREL, 2014; IWAYA et al., 2001). Como nas demais áreas da medicina regenerativa, esses procedimentos têm sido amplamente investigados nos últimos anos. Uma vez que, até o momento, nenhum material plástico foi capaz de reproduzir completamente as propriedades dos tecidos biológicos, o melhor substituto para uma estrutura dental perdida, é a própria estrutura dental (ROSA et al., 2013), justificando o empenho da comunidade científica em melhor elucidar os eventos celulares e moleculares que resultam na neoformação de tecidos dentários.

O número de amostras que serão utilizadas no experimento foi determinado a partir de cálculo amostral realizado com o objetivo de detectar uma diferença de até 5% na média dos valores obtidos, em poder de β = 95% e α = 5%. O cálculo indicou uma amostra de 5 espécimes por grupo e período experimental. Seguindo essa indicação, 165 terceiros molares superiores e inferiores, hígidos, doados por indivíduos entre 18 e 35 anos, serão utilizados no experimento. Após a doação e assinatura do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido pelos pacientes, os dentes serão imediatamente imersos no meio de transporte, composto por DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium - Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) suplementado com 20% soro fetal bovino (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA), 1% de penicilina e estreptomicina (cod 15140122, Invitrogen, EUA) e 1% de anfotericina B (cod 15290018, Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA), e mantidos em caixa térmica, a 4°C para o translado até o laboratório. Na sequência, os dentes serão lavados com solução tampão fosfato salina (1X PBS - Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA), e limpos com auxílio de pontas ultrassônicas para remoção dos tecidos periodontais.
Raízes completamente formadas e sem curvaturas serão utilizadas para preparar segmentos radiculares. Seguindo esses requisitos, estima-se que de cada dente será utilizada uma raiz (a palatal de molares superiores e a distal de molares inferiores). A coroa dental será removida por secção transversal da raiz utilizando um disco diamantado (ISOMET 5000; Buehler Ltd, Lake Bluff, IL, EUA), sob velocidade de 1000 rpm e refrigeração, de modo a se obter segmentos radiculares de comprimento padronizado em 10 mm (Figura 1A). Os canais serão preparados mecanicamente com instrumentos NiTi (Reciproc, VDW, Alemanha), no comprimento de 9 mm (Figura 1B), coadjuvado por irrigação de 20 mL de solução fisiológica (solução de cloreto de sódio 0,9%), utilizando seringa e agulha (Navi-Tip, Ultradent, Salt Lake City, Utah, EUA). Os instrumentos reciprocantes serão utilizados em um motor endodôntico (VDW Silver, VDW, Alemanha), seguindo as recomendações do fabricante. Os segmentos radiculares serão fixados em pontas de pipeta com material de impressão e submetidos a diferentes protocolos de tratamento, de acordo com o grupo experimental (n=5/grupo).
Os protocolos de tratamento serão compostos por 2 fases principais, tratamento químico e ativação da solução irrigadora. Na fase de tratamento químico, de acordo com o grupo experimental, os dentes serão submetidos a materiais utilizados para desinfecção (hipoclorito de sódio e pastas antimicrobianas) e para biodisponibilização de proteínas da matriz dentinária (EDTA). PBS será utilizado como controle-negativo do tratamento químico. Na fase de ativação da solução, serão utilizados dispositivos para aumentar a movimentação da solução irrigadora intracanal (pontas ultrassônicas ou XP-Endo Finisher). Os grupos de G4 a G11 serão submetidos a tratamento químico com hipoclorito de sódio (NaOCl – Farmácia de manipulação Natura – Pelotas, Rio Grande do Sul, Brasil) e diferentes medicações intracanal, simulando os procedimentos para desinfecção realizados na rotina clínica para a endodontia regenerativa. Para tanto, após o preparo mecânico dos dentes, os canais serão irrigados com 20 mL de NaOCl 1,5% (Figura 1C, Quadro 1), por 5 min de acordo com as recomendações da AAE (2016), utilizando seringa e agulha de irrigação (Navi-Tip). Na sequência, os canais serão secos com cones de papel absorvente e preenchidos com as devidas pastas para desinfecção (Figura 1D, Quadro 1), até 1mm do bordo cervical. O milímetro final será selado com restaurador provisório (Coltosol, Coltene, Altstätten, Suíça) (Figura 1E). A porção apical da raiz será recoberta com cera odontológica (Figura 1E), previamente à manutenção dos segmentos radiculares em 100% de umidade (submersos em PBS), em placas de 24 poços, vedadas com Parafilm. Os dentes serão armazenados a temperatura de 37ºC, por 4 semanas, com troca do PBS dos poços a cada 72 horas. Decorridas as 4 semanas, o restaurador provisório e a cera serão removidos, e os canais radiculares irrigados com 20 mL de solução fisiológica, para retirada das medicações intracanal. Posteriormente, todos os segmentos radiculares serão submetidos a protocolos de irrigação final, como descrito no Quadro 1. Nos grupos de irrigação ativada, os instrumentos para ativação serão introduzidos 1 mm aquém do ápice anatômico e utilizados por 1 minuto a cada ativação da solução. A ativação ultrassônica será realizada com pontas (E1, HELSE; Santa Rosa de Viterbo, SP, Brasil – Figura 2C e 3C) acopladas em aparelho ultrassônico (JetLaxis Sonic – Schuster; Santa Maria, RS, Brasil) vibrando em potência de 10%. A ativação com a XP-Endo Finisher (FKG Dentaire AS; La Chaux-de-Fonds, Neuchâtel, Suiça - Figura 2D e 3D) igualmente será realizada 1 mm aquém do ápice anatômico. Para o acionamento do instrumento será utilizando um contra-ângulo sob velocidade 800 a 1000 rpm e torque de 1 N.cm, de acordo com as recomendações do fabricante.Para a análise da liberação de TGF-β1 da dentina radicular, cada uma das alíquotas de 100µL coletadas e congeladas em nitrogênio líquido, será descongelada e submetida à quantificação da proteína por ensaio de imunoabsorção enzimática (enzyme-linked immunosorbent assay – ELISA). Análise espectrofotométrica será realizada em um leitor de microplacas com filtro ajustado para comprimento de onda de λ = 450 nm. Os valores individuais da liberação de TGF-β1 de cada amostra servirão para compor o somatório e determinação do valor total de TGF-β1 liberado pela amostra.Para o ensaio ELISA, as médias dos valores de TGF-β1 liberado nos diferentes grupos serão analisados através do teste não paramétrico Mann-Whitney.

A meta é quantificar da liberação de TGF da matriz dentinária, por meio de ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA), de canais radiculares tratados com EDTA, ativado com pontas ultrassônicas e XP-Endo Finisher, e pastas antimicrobianas.