Nome do Projeto
Efeito do uso de hormonioterapia em éguas gestantes sadias e seus neonatos
Ênfase
Pesquisa
Data inicial - Data final
15/01/2020 - 15/12/2023
Unidade de Origem
Coordenador Atual
Área CNPq
Ciências Agrárias
Resumo
As complicações gestacionais em éguas, principalmente no terço final de gestação, representam um grande problema para a indústria equina, podendo acarretar em consequências maternas, fetais e neonatais (BUCCA, 2006). A garantia de uma gestação adequada abrange as trocas metabólicas entre a égua e o potro e a manutenção do ambiente uterino para o desenvolvimento fetal (REGNAULT et. al., 2002 e WILSHER; ALLEN, 2003). Em razão das perdas financeiras geradas pelos problemas gestacionais, há um estímulo para a utilização de ferramentas de diagnóstico e o tratamento das éguas afetadas (MACPHERSON & BAILEY, 2008). A unidade feto-placentária consiste de um sistema intrínseco que envolve o endométrio da égua, o feto e as membranas fetais, sendo responsável pelas trocas metabólicas entre a mãe e o feto (LEISER & KAUFMANN, 1994) e por produzir e metabolizar grandes quantidades de hormônios esteróides (estrógenos, progestágenos e andrógenos) (OUSEY, 2006). A placentite cursa com redução das trocas entre a mãe e o feto, bem como alterações da dinâmica hormonal. O tratamento da placentite visa bloquear a multiplicação bacteriana, reduzir a liberação de mediadores inflamatórios e manter a quiescência miometrial (MACPHERSON & BAYLE, 2008). Aliado ao tratamento convencional com a utilização de antibióticos e antiinflamatórios, a hormonioterapia é utilizada para manutenção da gestação, viabilizar o desenvolvimento fetal e evitar a contratilidade uterina. Como terapia hormonal é descrita administração de progestágenos sintéticos e sugere-se a associação de estrógenos no tratamento. Ambos os hormônios são produzidos pela unidade feto-placentária e apresentam alteração da produção frente à injúria intra-uterina. Poucos estudos descrevem os efeitos de terapias hormonais em éguas gestantes sadias, sendo estes necessários para compreender a farmacocinética dos medicamentos e a influência dos mesmos no terço final de gestação e viabilidade neonatal.

Objetivo Geral

O projeto tem como objetivo avaliar o efeito do tratamento hormonal no terço final de gestação em éguas sadias e sua influência na hemodinâmica uterina, no desenvolvimento e viabilidade neonatal.
Objetivos Específicos:

 Avaliar a hemodinâmica do trato reprodutivo através de ultrassonografia de Doppler;

 Avaliar níveis plasmáticos de progestágenos e estrógenos em éguas gestantes tratadas com diferentes terapias hormonais e sua relação com a expressão destes na placenta;

 Identificar a expressão de progestágenos e estrógenos α e β, e seus respectivos receptores na placenta equina no pós-parto imediato;

 Relacionar a hormonioterapia com a quantificação de receptores de progestágenos e estrógenos α e β na placenta;

 Avaliar o efeito da hormonioterapia, bem como da expressão de receptores dos mesmos na placenta e endométrio;

 Realizar avaliação histopatológica e histomorfometrica das placentas;

 Avaliar características de maturidade dos potros ao nascimento e viabilidade até cinco dias de vida.

Justificativa

As complicações gestacionais em éguas, principalmente no terço final de gestação, representam um grande problema para a indústria equina, podendo acarretar em consequências maternas, fetais e neonatais (BUCCA, 2006). A garantia de uma gestação adequada abrange as trocas metabólicas entre a égua e o potro e a manutenção do ambiente uterino para o desenvolvimento fetal (REGNAULT et. al., 2002 e WILSHER; ALLEN, 2003). Em razão das perdas financeiras geradas pelos problemas gestacionais, há um estímulo para a utilização de ferramentas de diagnóstico e o tratamento das éguas afetadas (MACPHERSON & BAILEY, 2008). A placentite é a causa mais frequente de aborto e ocorrência de natimorto, representando mais de 30% dos partos prematuros e mortes neonatais dentro das primeiras 24 horas de vida (McKINNON, 2009). A unidade feto-placentária consiste de um sistema intrínseco que envolve o endométrio da égua, o feto e as membranas fetais, sendo responsável pelas trocas metabólicas entre a mãe e o feto (LEISER & KAUFMANN, 1994) e por produzir e metabolizar grandes quantidades de hormônios esteróides (estrógenos, progestágenos e andrógenos) (OUSEY, 2006). A placentite cursa com redução das trocas entre a mãe e o feto, bem como alterações da dinâmica hormonal. O tratamento da placentite visa bloquear a multiplicação bacteriana, reduzir a liberação de mediadores inflamatórios e manter a quiescência miometrial (MACPHERSON & BAYLE, 2008). Aliado ao tratamento convencional com a utilização de antibióticos e antiinflamatórios, a hormonioterapia é utilizada para manutenção da gestação, viabilizar o desenvolvimento fetal e evitar a contratilidade uterina. Como terapia hormonal é descrita administração de progestágenos sintéticos e sugere-se a associação de estrógenos no tratamento. Ambos os hormônios são produzidos pela unidade feto-placentária e apresentam alteração da produção frente à injúria intra-uterina. No início da gestação a progesterona é produzida pelos corpos lúteos acessórios, sendo necessária para manutenção da quiescência uterina. A partir da segunda metade da gestação, em torno dos 120 a 150 dias, os progestágenos são produzidos pelo feto e unidade feto-placentária (BARNES, et al. 1975; PASHEN, 1984). A síntese de progestágenos é baseada no metabolismo da pregnanolona produzida pelas glândulas adrenais fetais. As concentrações plasmáticas maternas de progestágenos aumentam significativamente nas últimas semanas de gestação, tendo uma queda acentuada durante os últimos dias, ou mesmo horas, pré-parto (OUSEY, 2006). Em éguas com gestações de risco é recomendada a suplementação com progestágenos sintéticos, como altrenogest, para prevenir o aborto, através da manutenção da quiescência miometrial e da função secretora endometrial na ausência de progestinas endógenas (BAILEY et al., 2010). Na medicina humana, estudos clínicos têm demonstrado efeito positivo do tratamento com agentes progestágenos administrados em mulheres com histórico prévio de parto prematuro
(LIM et al., 2010). Em um estudo experimental com indução de placentite ascendente realizado por Bailey et al (2010) foi observada maior viabilidade dos potros nascidos de éguas tratadas com altrenogest. No entanto, outro estudo descreve que o tratamento com altrenogest em éguas sadias não impediu o parto,que ocorreu antes das éguas do grupo controle, sugerindo que sua eficácia na prevenção do aborto e parto prematuro é duvisosa, ainda, o tratamento com altrenogest influenciou negativamente a adaptação neonatal no ambiente extra-uterino (NEUHAUSER et al, 2008). Já o estrógeno fetal atua na estimulação das mudanças quantitativas e qualitativas do histotrofo em conceptos jovens, bem como no aumento do fluxo sanguíneo uterino, diretamente, ou via estímulo de produção endometrial de prostaglandina, em diversas espécies (BAZER & FIRST, 1983; MCDOWELL, et al. 1987). Em humanos, há questionamento sobre o efeito vasodilatador de estradiol e progesterona, porém tem sido proposto que em gestações acompanhadas por hipertensão esses hormônios esteroides assumem níveis decrescentes em mulheres (WHITE, et al., 1995; BHANSALI & EUGERE, 1992). Em equinos, um estudo conduzido por Pashen & Allen (1979), onde avaliou fetos em com gonadectomia, o tempo gestacional foi normal, entretanto os partos foram caracterizados por contrações miometriais fracas e ausência de incremento da prostaglandina F no soro materno. Os potros também apresentaram redução severa no desenvolvimento muscular. A partir disso, a utilização de estrógeno como auxiliar na terapia para placentite tem sido proposto (STOUT & ALLEN, 2001; DOUGLAS, 2004). Na avaliação do perfil hormonal realizado por Canisso et al. (2012) em modelos experimentais de indução de placentite ascendente foi constatada queda abrupta dos níveis de 17β estradiol após inoculação, o que pode sugerir a necessidade de suplementação com estrógenos. Além disso,associação de ECP no tratamento de éguas com placentite induzida promoveu o nascimento de potros em condições similares a éguas sadias, sendo considerados de baixo risco, com peso ao nascer similar e sem características de imaturidade, enquanto que o uso de altrenogest não influenciou positivamente a viabilidade dos potros (CURCIO et al, 2017). Estudos experimentais demonstram que os estrógenos aumentam o fluxo sanguíneo uterino em várias espécies (FERREL & FORD, 1980). Em ovinos, foi observado o efeito vasoativo na perfusão uterina após aplicação exógena de estrogênio (ROSENFELD et al., 1976). Na espécie equina, há descrições da relação altamente significativa entre os parâmetros do fluxo sanguíneo e as concentrações de estrógenos (DAELS et al., 1991). Em éguas vazias, durante o estro há uma correlação negativa entre os índices de resistividade do fluxo sanguíneo uterino e a concentração plasmática de estrógeno (BOLLWEIN et al, 2002). A ultrassonografia Doppler é uma técnica não invasiva recentemente utilizada para a avaliação transretal do fluxo sanguíneo do trato reprodutivo de animais de grande porte e é considerada como sendo uma das melhores técnicas disponíveis para o estudo in vivo da hemodinâmica uterina em éguas (GINTHER, 2007). No entanto, não foram encontrados estudos que avaliem a o fluxo sanguíneo uterino em éguas tratadas com
estrógeno e progesterona no terço final da gestação.

Metodologia

Animais a serem utilizados no estudo:
Serão utilizadas 45 éguas gestantes mestiças crioulas e seus respectivos potros, sendo 20 éguas oriundas do Centro de Experimentação em Equinocultura da Palma e as demais de uma propriedade na região de Cristal, RS. Todas as éguas serão submetidas ao acompanhamento do ciclo e inseminação artificial em data conhecida. As éguas serão distribuídas aleatóriamente em três grupos, sendo: 1) Grupo ECP (n=15); 2) Grupo Altrenogest (n=15); e, 3) Grupo Controle (n=15). Serão monitoradas a partir do 5º mês de gestação através de ultrassonografia transretal com uso de transdutor linear de 5-7.5 MHz para avaliar o espessamento da junção útero placentária (JUP) na porção caudal da placenta, presença de exsudato, de separação do córioalantóide do endométrio e características dos fluídos fetais (BUCCA, 2005). A avaliação da JUP será realizada conforme descrito por Reunaudin et al. (1997), sendo considerado valores normais menores que 8mm entre 271 e 300 dias de gestação, até 10mm entre os dias 301 e 330, e menores que 12mm aos 300 dias de gestação.
Terapias hormonais e coletas:
As éguas serão submetidas a tratamentos hormonais de acordo com os grupos, sendo todos os tratamentos iniciados aos 300 dias de gestação e mantidos até o momento do parto. O grupo ECP será tratado com Cipionato de Estradiol na dose de 10mg, via intramuscular, a cada cinco dias. Já o grupo altrenogest será tratado na dose de 300mg, via intramuscular, a cada sete dias. Serão realizadas coletas a partir dos 300 dias de gestação, prévio ao início do tratamento hormonal, com intervalo de cinco dias até o momento do parto. Cada coleta será realizada através de venopunção da jugular, em tubo com anticoagulante heparina e outro sem anticoagulante. As amostras serão centrifugadas a 5000 rpm para separação e obtenção do plasma e soro, sendo armazenadas em freezer -80°C até o momento das análises. Além disso, será realizada a coleta de muco cervical através da palpação externa da cérvix via transvaginal aos 300 e 330 dias de gestação. Será realizada a citologia do muco e armazenamento a -196ºC em nitrogênio líquido. Serão realizadas dosagens séricas dos hormônios progesterona, estrógeno 17β e relaxina nas amostras provenientes das éguas , sendo as mensurações serão realizadas pelo método de quimioluminescência (HIRAHARA et al., 2013).
Hemodinâmica uterina:
A ultrassonografia Doppler é uma técnica não invasiva recentemente utilizada para a avaliação transretal do fluxo sanguíneo do trato reprodutivo de animais de grande porte e é considerada como sendo uma das melhores técnicas disponíveis para o estudo in vivo da hemodinâmica uterina em éguas (GINTHER, 2007). A avaliação da hemodinâmica uterina será realizada com o uso de ultrassonografia transretal com doppler no modo espectral, utilizando os índices de RI e PI, conforme descrito por Bollwein et al (1998). Ao localizar a artéria ilíaca externa, move-se o transdutor linear, direcionado para o dorso do animal, de um lado a outro longitudinalmente à aorta em busca das artérias uterinas esquerda e direita. A partir destas serão obtidas ondas espectrais através dos ciclos cardíacos gerados. Posteriormente, serão selecionadas três ondas de aspecto semelhante e retirados manualmente os valores dos índices obtidos no modo semi automático. As avaliações serão realizadas com intervalo de 5 dias iniciando aos 290 dias de gestação até o momento do parto.
Parto e coletas do neonato:
Todos os partos serão acompanhados por equipe treinada, a partir dos 300 dias de gestação as éguas serão encaminhadas para piquetes de fácil observação, no momento da ruptura do corioalantóide, será realizada a palpação transvaginal para avaliar a estática fetal e a égua encaminhada para baia de maternidade. Os partos serão acompanhados para realização de qualquer intervenção caso seja necessário e a avaliação do neonato no pós-parto será realizada através de inspeção, observação dos reflexos posturais e comportamentais, e exame clínico completo. Os neonatos que apresentarem-se de forma debilitada, ou demonstrarem qualquer alteração clínica nas avaliações serão submetidos a tratamento de suporte necessário. Serão realizadas coletas de sangue do neonato logo após o parto para hemogasometria, hemograma, lactato, glicose, plasma e soro. As coletas para hemogasometria venosa, para monitorar equilíbrio ácido base e oxigenação, serão realizadas ao nascimento, 15min, 30min, 45min , 1h, 12h e 24h após o parto através de venopunção da veia jugular (Hodgson, 1987). As avaliações de hemograma, lactato e glicose séricos serão realizadas ao nascimento, 24h, 48h e 5 dias de vida. Já as coletas de soro e plasma de heparina serão realizadas ao nascimento, 30min, 1h, 12h, 24h, 48h e 5 dias após o parto.
Avaliação da placenta e coletas:
Logo após a expulsão das membranas fetais, a placenta será pesada e disposta em formato “F” para avaliação macroscópica, sendo ambas as faces, alantoideana e coriônica, avaliadas em busca de alterações de coloração, espessamento, presença de secreções e áreas de avilosidades (Schlafer, 2004). Será realizada a medida das porções de corno gravídico, corno não gravídico, corpo e cordão, conforme descrito por Wilsher et al (2013). Após, serão colhidos fragmentos placentários de “3x3”cm do corpo uterino, corno gravídico, corno não gravídico, estrela cervical, bifurcação, âmnion e cordão umbilical. Os fragmentos serão armazenados em solução de formalina tamponada 10% para fixação, com posterior realização de exame histopatológico. Outros fragmentos, dos mesmos locais de coleta, serão armazenados em solução de formalina tamponada 10% durante 24horas para fixação, sendo posteriormente, armazenados em álcool 70º. Além disso, serão coletados fragmentos de 0,5x0,5cm de corpo uterino, corno gravídico e corno não gravídico e armazenados em criotubos contendo RNA Later, estes serão armazenados na geladeira por 12 horas e posteriormente mantidos em freezer -80ºC. Além disso, até 12 horas pós-parto será realizada biopsia uterina para obtenção de dois fragmentos, sendo um destinado à avaliação histopatológica e outro ao armazenamento em RNA Later.
Teste de estimulação com ACTH:
O teste de estimulação com ACTH será realizado entre 16 e 18 horas após o nascimento. Será realizada a tricotomia da região da veia jugular e fixação de cateter 18G, com o auxílio de extensor heparinizado as coletas serão realizadas com o mínimo de intervenção. A primeira coleta ocorrerá 30 minutos antes da administração de 0,125mg de ACTH (Synacthen), que ocorrerá via endovenosa. Após a aplicação, serão realizadas colegas 15, 60, 90 e 120 minutos. As coletas serão realizadas em tubos com heparina para separação do plasma, que será armazenado em freezer -20ºC até o processamento.
Avaliação da histopatologia e histomorfometria placentária:
Será realizado processamento dos fragmentos em formalina tamponada 10% em blocos de parafinas, a partir dos quais serão realizados cortes de 3-5μm montados sobre lâminas, desparafinizados, hidratados e corados pelo método do hematoxilina-eosina. As lâminas serão avaliadas por microscopia de luz. A partir das lâminas histológicas serão realizadas imagens digitalizadas, em microscópio de campo claro Olympus BX51 com câmera de alta resolução DP-73, com aumento de 100x. as imagens serão submetidas a avaliação pelo programa de domínio público ImageJ, a partir de método semi-automatizado. Serão realizadas medidas de áreas microcotiledonárias e vasculares do alantocórion, as quais terão no mínimo, dez mensurações de diferentes cortes de cada fragmento placentário, sendo três fragmentos placentários distintos de cada animal para obtenção da média (minimizando o CV da técnica de mensuração). As medidas vasculares compreenderão capilares terminais de região de microcotilédones e vasos da porção alantoideana placentária.
Receptores mRNA:
Através das amostras de placenta e endométrio armazenadas em RNA Later será realizada a avaliação da expressão do mRNA para receptores de estrógeno alpha (ESR1), receptores de estrógeno beta (ESR2), receptores de progesterona (PGR), prostaglandina E2 tipo 2 (PTGER2) e tipo 4 (PTGER4).

Indicadores, Metas e Resultados

Espera-se determinar a influência do tratamento com estrógeno e progesterona em éguas sadias na hemodinâmica uterina e viabilidade dos neonatos, buscando compreender como essas medicações auxiliam no tratamento de patologias durante a gestação. Com o
desenvolvimento deste estudo será possível a integração e treinamento de pessoas vinculadas a universidade, propiciando o crescimento técnico-científico dos alunos envolvidos no grupo de pesquisa. Além disso, este projeto da continuidade ao trabalho elaborado pelo grupo buscando a abordagem científica de situações encontradas na rotina de veterinários de campo, dando sequência ao vinculo e contribuição para ambos.

Equipe do Projeto

NomeCH SemanalData inicialData final
ANDRESSA GARCIA MOTTA
BRUNA DA ROSA CURCIO2
BRUNA DOS SANTOS SUÑÉ MORAES
CAMILA GERVINI WENDT
CARLOS EDUARDO WAYNE NOGUEIRA4
ELIZA MOREIRA PIEMOLINI
GABRIELA CASTRO DA SILVA
ISADORA PAZ OLIVEIRA DOS SANTOS
MARIANA ANDRADE MOUSQUER
NATHALIA DE OLIVEIRA FERREIRA
NATÁLIA BUCHHORN DE FREITAS
NATÁLIA RIBEIRO PINTO
PALOMA BEATRIZ JOANOL DALLMANN
RAFAELA PINTO DE SOUZA
TATIANE LEITE ALMEIDA

Fontes Financiadoras

Sigla / NomeValorAdministrador
CAPES / Coordenação de Aperfeiçoamento de Nível SuperiorR$ 600,00Coordenador

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