Nome do Projeto
Avaliação da atividade desinfetante de nanocápsulas a base do óleo essencial de Tagetes minuta L. no manejo de ordenha de vacas leiteiras
Ênfase
Pesquisa
Data inicial - Data final
15/03/2020 - 28/02/2022
Unidade de Origem
Coordenador Atual
Área CNPq
Ciências Agrárias
Resumo
Dentre os métodos de prevenção da mastite, principal doença dos rebanhos leiteiros, destaca-se a desinfecção da pele dos tetos para reduzir a carga microbiana e prevenir a ocorrência de infecções intramamárias. Embora no mercado, existem diversas opções de desinfetantes à base de iodo, cloro e clorexidine, há registros da ocorrência de resíduos dos mesmos no leite e de agressões à pele do teto dos animais. Portanto, é importante que existam métodos alternativos para sistemas de produção diferenciados como o orgânico ou agroecológico. Neste sentido, destacam-se as plantas medicinais que vêm sendo usadas há muito tempo para o tratamento de enfermidades e desinfecção de superfícies. A espécie Tagetes minuta L. é um subarbusto de pequeno porte que cresce espontaneamente em áreas de cultivos anuais. Dentre as características biocidas dos óleos essenciais dessa espécie destacam-se principalmente a atividade antifúngica, antiparasitária e antimicrobiana. No entanto, apesar das atividades biológicas demonstradas pelos óleos essenciais de T. minuta, seu caráter lipossolúvel e de volatilidade, limitam o seu uso. Desse modo, para contornar tais limitações tem-se buscado a associação com a nanotecnologia, visando proporcionar maior estabilidade, potencialidade e proteção dos compostos ativos. A partir da atual demanda por produtos diferenciados e sustentáveis, este estudo tem como objetivo avaliar o uso de nanocápsulas a base de óleo essencial de T. minuta no manejo de ordenha como pós-dipping. O óleo será extraído pela técnica de arraste a vapor e as nanocápsulas feitas pela técnica de precipitação do polímero pré-formado, seguido de evaporação do solvente. Inicialmente, a atividade desinfetante in vitro será avaliada frente às cepas padrão das bactérias Staphylococcus aureus ATCC 6538 e Pseudomonas aeruginosa ATCC 15442 e frente a 5 isolados de fungos do complexo Sporothrix, segundo a Norma Europeia BS EN 1040:2005 com adaptações. Posteriormente, será realizado o teste in vivo, utilizando 32 animais da raça holandês, com estágio de lactação e escore de condição corporal similares. Os animais serão divididos em 2 grupos, grupo controle (GC) receberá o manejo convencional com iodo e o outro com as nanocápsulas de T. minuta (GN). Em todas as vacas, será passado um suabe nos tetos logo após a retirada do conjunto de teteiras. Em seguida, os animais de cada um dos grupos (GC ou GN) receberão seu respectivo tratamento em dois tetos cruzados, anterior esquerdo/direito e posterior direito/esquerdo. Após 15 segundos de contato com o produto, os microrganismos da pele do teto serão novamente coletados com suabe. As amostras serão acondicionadas em solução salina isotônica e refrigeradas para posterior semeadura em placas de meio padrão para contagem. As amostras coletadas antes do tratamento servirão para verificar a carga e diversidade microbiana e as amostras coletadas após a aplicação dos produtos para fazer a avaliação da redução desta carga. Será possível então gerar um índice de redução, comparando os tratamentos, GC (iodo) e GN (nanocápsulas de T. minuta). Com isso, espera-se o desenvolvimento de um produto alternativa para desinfecção de tetos no manejo de ordenha de vacas leiteiras, adequando práticas sustentáveis necessárias à produção de leite agroecológico e orgânico.

Objetivo Geral

Avaliar a atividade desinfetante in vitro e in vivo de nanocápsulas do óleo essencial de T. minuta, visando o seu uso no manejo de ordenha como pós dipping de vacas leiteiras.

Justificativa

Dentre as atividades agropecuárias, o setor leiteiro é um dos que está em constante crescimento. Por ser uma linha primária na produção de alimentos é mantida majoritariamente em países em desenvolvimento por pequenos e médios produtores, representando para os mesmos uma fonte de renda mensal. Além de ter retorno em curto prazo, gera empregos diretos e indiretos. Em 2017, o Brasil ocupou a quinta colocação no ranking mundial produzindo cerca de 35 milhões de toneladas de leite (JUNG & JÚNIOR,
2017; CONAB, 2017).
Uma das etapas desafiadoras na pecuária leiteira é a sanidade do rebanho e do ambiente. Os manejos produtivo e mais especificamente o de ordenha exigem métodos eficientes de desinfecção dos equipamentos, das instalações e principalmente dos tetos das vacas. Tais medidas são importantes para prevenir o contágio dos animais com microrganismos responsáveis pela ocorrência da principal enfermidade de rebanhos leiteiros, a mastite. Esta é uma doença plurietiológica e multifatorial caracterizada pela inflamação da glândula mamária. Além de gerar prejuízos aos produtores, reduz a quantidade e a qualidade do leite e também altera o quadro de bem-estar animal (FOGSGAARD et al., 2015).
Grande parte das unidades de produção leiteira apresentam alguma forma de carência no controle e manejo higiênico-sanitário. Como consequência tem-se a alta prevalência de mastite nos rebanhos, sendo esta doença a mais predominante entre as enfermidades (ROWE et al., 2018, GARVEY et al., 2016, LAGO et al., 2016). Desse modo, é crescente a importância do desenvolvimento de tecnologias que contribuam para melhores níveis de produção.
Considerando a demanda por produtos diferenciados no que diz respeito ao modelo tecnológico, muitos trabalhos vêm mostrando resultados promissores. Um exemplo é o uso de plantas e suas variações com propriedades importantes na medicina veterinária (GARCÍA-SALINAS et al., 2018, ABBAS et al., 2018, CHANDRA et al., 2017). Além dos produtos existentes no mercado, é crescente a demanda da sociedade pelo uso de alternativas mais sustentáveis e viáveis do ponto de vista econômico e ambiental (ORGANIS, 2017).
Além disso, o desenvolvimento de microrganismos resistentes aos produtos atuais é preocupante e coloca em risco não só a sanidade dos rebanhos como também a saúde pública (WATTS & SWEENEY, 2010).
Com intuito de buscar alternativas para desinfecção de superfícies, mais especificamente da superfície da pele do teto de vacas leiteiras, o presente projeto traz à tona o uso de plantas com características desinfetantes e antimicrobianas. Há diversos exemplos na literatura como Senna macranthera, Artemisia absinthium, Cymbopogon nardus, Achyrocline satureioides, Eucalyptus ssp, Baccharis trimera e T. minuta (DIAZ et al., 2010; BOTH et al., 2016; SCHUCH et al., 2007, SANTOS et al., 2017). As propriedades
antimicrobianas já foram demonstradas tanto para plantas in natura, como para extratos e óleos essenciais (GARCÍA-SALINAS et al., 2018).
T. minuta, é uma planta originária do México e foi introduzida no Brasil há muitos anos (MOREIRA, 1996). Pertence à família Asteracea ou Compositae e cresce espontaneamente na região sul do Brasil nos meses de primavera e verão. É um subarbusto pouco ramificado, ereto e com odor característico. Possui pequenas flores amarelas, podendo atingir até 2 metros de altura, sendo conhecida popularmente pelo nome de chinchilho ou cravo-de-defunto (KISSMANN & GROTH, 1992; SCHIAVON et al., 2015). Tanto o extrato como o óleo essencial de T. minuta são reconhecidos pelas suas propriedades antifúngica, antioxidante, antinflamatória, citotóxica, carrapaticida, larvicida e antimicrobiana (KUMAR, 2019; IBRAHIM et al., 2018; SANTOS et al., 2017; ALI et al., 2014; ANDREOTTI et al., 2014; SOUZA et al., 2000). No entanto, de maneira geral, a aplicação de óleo essencial apresenta algumas limitações, principalmente quanto a sua volatilidade. Desse modo, a associação da nanotecnologia representa uma alternativa melhorando a
estabilidade, funcionalidade e potencialidade do produto em questão (ANWER et al., 2014).
A nanotecnologia facilita ainda a aplicabilidade de compostos hidrofóbicos que poderá ser usado em diversas formas como spray, cremes e espuma. Também tem a vantagem do uso de menores concentrações e consequente redução de custo e risco de toxicidade. Protege o óleo essencial de
instabilidades térmicas, de volatilização e propicia a dissolução e estabilização dos princípios ativos (BAJERSKI et al., 2016; CONSTANTINIDES, 2008; BOUCHEMAL, 2004).
As nanocápsulas de T. minuta foram desenvolvidas em um trabalho anterior pelo grupo de pesquisa do LABINAT. Além do desenvolvimento das nanocápsulas, foram realizadas previamente as avaliações in vitro do seu potencial antimicrobiano e desinfetante (BOLZAN, 2018). Sendo assim, o presente projeto pretende dar continuidade a esse estudo, através da sua avaliação in vivo como desinfetante no manejo da ordenha.

Metodologia

As etapas de laboratório serão realizadas no Laboratório de Saúde Coletiva – LASC, do Departamento de Medicina Veterinária Preventiva na Universidade Federal de Pelotas (UFPEL) no Rio Grande do Sul, em parceria com o Laboratório de Micologia Veterinária da Universidade Federal de Pelotas (UFPel), o Laboratório de Pesquisa em Produtos Naturais – LPPN do Departamento de Química Orgânica da UFPel e também no Laboratório de Bioquímica e Produtos Naturais – LABINAT do Departamento de Zootecnia e Desenvolvimento Rural na Universidade Federal de Santa Catarina (UFSC).
A produção e avaliação do Óleo essencial será a partir de plantas colhidas em áreas de crescimento espontâneo na região sul do Rio Grande do Sul. A identificação dos compostos será realizada considerando os resultados obtidos em bibliotecas de massa (software GCMSSolution) do Centro de Análises do Departamento de Engenharia Química da UFSC.
A preparação das nanocápsulas será com a técnica de nanoprecipitação ou deposição de polímero interfacial - deslocamento de solvente conforme metodologia de BOLZAN, (2018).
O produto será preparado conforme a demanda dos testes in vitro e in vivo e armazenadas ao abrigo da luz e sob refrigeração (4ºC) para posterior uso por um período máximo de 15 dias.
A atividade desinfetante e antisséptica das nanocápsulas será conforme a Norma Padrão Europeia (BSEN1040, 2005) para teste desinfetante, com adaptações. Serão utilizadas cepas bacterianas de S. aureus ATCC 6538 e P. aeruginosa ATCC 15442 e 5 isolados fúngicos de Sporothrix spp armazenados na micoteca do Laboratório de Micologia Veterinária da Universidade Federal de Pelotas (UFPel). A partir dos resultados dos testes in vitro uma das concentrações será escolhida para que possa ser empregada no teste in vivo durante o manejo da ordenha.
O estudo in vivo será realizado na região Sul do estado do Rio Grande do Sul na COOPAVA - Cooperativa de Produção Agropecuária Vista Alegre LTDA.
Os animais utilizados serão bovinos fêmeas da raça holandês com idade entre 24 e 60 meses, pesando de 420 a 650 Kg e em estágio de lactação. Os animais ficarão alojados em instalações tipo piquete com área aproximada de 50 m2/animal, a campo, com iluminação natural, disponibilidade de água em bebedouros, alimentados a base de pasto e com suplementação de silagem e ração balanceada no cocho após a ordenha. Os animais que participarão do presente projeto deverão ter os quatro quartos mamários íntegros e funcionais, sem apresentar sinais de mastite clínica. Caso apresentem algum sinal de doença durante o experimento, esses animais serão excluídos do estudo e destinados ao tratamento adotado na propriedade.
Os animais passarão pelo manejo habitual, com exceção da troca do produto a ser utilizado como pós-dipping e a realização da passagem de um suabe estéril na porção externa de cada teto para coleta de amostras. Em seguida desta prática, os mesmos receberão o dipping de rotina da propriedade, a fim de evitar exposição dos tetos aos patógenos.
As abordagens do estudo não sairão da rotina em que os animais já estão habituados, ou seja, a rotina da ordenha. Não haverá nenhum tipo de procedimento invasivo ou nocivo aos mesmos, sendo assim descartada qualquer possibilidade de dano ou necessidade de eutanásia às vacas.
Participarão do estudo um número total de 32 vacas, divididas aleatoriamente em dois grupos com 16 animais. Na semana 1, o GC será tratado com iodo 0,5% nos tetos AD e PE e os tetos AE e PD receberão as nanocápsulas de T. minuta. Os animais do GN receberão nanocápsulas nos tetos AD e PE e iodo 0,5% nos tetos AE e PD. Este processo se dará por três dias consecutivos. Na semana 2, os tratamentos dos animais de cada um dos grupos serão invertidos, bem como os tetos tratados, os animais que receberam iodo receberão as nanocápsulas e os que receberam as nanocápsulas receberão o iodo, também em três repetições.
Em caso de chuva antes ou durante o dia de coleta, esta será adiada, a fim de evitar possíveis variações nos níveis de contaminação do úbere devido a umidade e lama. As coletas serão retomadas quando houver o intervalo de pelo menos 24 h sem chuva.
Para a coleta e acondicionamento das amostras os animais terão uma pré-avaliação referente ao estado sanitário, estágio de lactação, ECC e coformação de úbere. As vacas selecionadas para o estudo terão suas coletas realizadas durante a ordenha da manhã.
A coleta se dará sempre pela mesma pessoa e da seguinte maneira. Logo após a retirada das teteiras cada vaca terá os quatro tetos coletados/esfregados com suabes estéreis, embebidos em solução salina isotônica (NaCl 0,9%). A coleta será realizada nas laterais do teto, desde a metade até seu ápice, esfregando 5 vezes para cima e para baixo de um lado e do outro e mais um contato da ponta do suabe com o esfincter do teto, girando duas vezes para um lado e para o outro. Esta primeira coleta é para verificação de carga e diversidade microbiana antes da aplicação do produto.
Em seguida, utilizando copo dosador sem retorno, será aplicado um dos produtos em dois tetos cruzados, iodo ou nanocápsulas dependendo a qual grupo o animal pertencer e nos outros dois tetos o outro produto. O produto (iodo ou as nanocápsulas) ficará em contato com a pele por 15 segundos e em seguida será realizada a coleta pós aplicação. Esta coleta se dará igualmente a primeira, porém, nas porções anterior e posterior do teto.
O acondicionamento dos suabes coletados pré e pós aplicação se dará em tubos do tipo Falcon com solução de imersão e refrigeração de 2ºC a 8ºC para cultura nas primeiras 12 h.
Após todo procedimento das coletas, os animais receberão nos 4 tetos o pós-dipping da rotina da propriedade, a fim de evitar exposição das vacas a patógenos e possíveis riscos de infecções.
No total, serão 128 suabes das coletas pré aplicação e outros 128 suabes dos tratamentos, 64 do iodo e 64 das nanocápsulas, totalizando 256 amostras diárias.
A terceira etapa será realizada no Laboratório de Saúde Coletiva – LASC, do Departamento de Medicina Veterinária Preventiva na Universidade Federal de Pelotas (UFPEL) no Rio Grande do Sul, onde será feito o cultivo, isolamento, caracterização e contagem bacteriana.
Após o término das coletas a campo, os conteúdos dos tubos Falcon aonde estavam armazenados os suabes serão diluídos e semeados em placas. As diluições serão seriadas para realização da contagem nas placas em ágar PCA –Ágar Padrão para Contagem, gerando um número de redução (RED) pela diferença no antes e depois do uso dos produtos desinfetantes.
Conforme metodologia modificada de Schuch et al. (2007), esses valores serão transformados em um índice de redução através da fórmula IINIB=log(1+CBF)/log(1+CBI), onde IINIB significa o índice de inibição; CBF contagem bacteriana final e CBI contagem bacteriana inicial. Se utilizará logaritmo para normalizar os resultados e se acrescentará uma unidade ao resultado a fim de permitir a utilização de logaritmo em amostras que porventura venham a apresentar o valor 0.

Indicadores, Metas e Resultados

Espera-se com este estudo o desenvolvimento de uma nova alternativa de produto para desinfecção de tetos no manejo de ordenha de vacas leiteiras adequando práticas sustentáveis e aceitáveis na produção orgânica;
Trazer benefícios aos produtores com melhor qualidade do leite produzido, maior acesso aos produtos de desinfecção bem como beneficiar os animais com melhores condições sanitárias, refletindo em sua produção e saúde.

Equipe do Projeto

NomeCH SemanalData inicialData final
DANIEL FERREIRA RIBEIRO
DANIELA APARECIDA MOREIRA
FELIPE FERREIRA DA ROSA
HANIEL MONTEIRO CARVALHO
JACKELINE VIEIRA LIMA
JOAO LUIZ ZANI1
LAURA CAROLINA CRISTOFOLI MULLER
LUANA CATARINA FERREIRA RIBEIRO
LUIZ FILIPE DAME SCHUCH6
RENATA OSORIO DE FARIA1

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