Nome do Projeto
Avaliação do efeito do tipo antidepressivo de 1,2,3-triazoil-acetofenonas em camundongos
Ênfase
Pesquisa
Data inicial - Data final
02/03/2020 - 02/03/2023
Unidade de Origem
Coordenador Atual
Área CNPq
Ciências Biológicas
Resumo
A depressão é uma condição clínica que atinge uma parcela significativa da população mundial e afeta de forma negativa a vida dos portadores desta patologia. O principal mecanismo patogênico proposto para a depressão está ligado ao déficit de neurotransmissores monoaminérgicos no sistema nervoso central, especialmente a serotonina (5-HT), sendo essa redução ocasionada por diferentes mecanismos. A 5-HT é responsável por diversas funções no organismo, entre essas o controle do humor. A monoamina oxidase (MAO) é a enzima responsável por degradar os neurotransmissores monoaminérgicos e apresenta-se sobre duas isoformas, denominadas MAO-A e MAO-B. Existem diversos fármacos disponíveis para o tratamento da depressão, com diferentes mecanismos de ação, embora todos esses fármacos ainda apresentem diversos efeitos adversos e muitos pacientes são refratários ao tratamento. Dentre os fármacos utilizados para o tratamento da depressão, estão os chamados inibidores da monoamina oxidase (IMAO), que são responsáveis por aumentar as concentrações de serotonina e outras monoaminas na fenda sináptica, reduzindo dessa forma os sintomas da doença. Baseando-se na necessidade do desenvolvimento de novas alternativas terapêuticas para a depressão, torna-se importante a descoberta de novas moléculas com efeito antidepressivo que, além de reduzirem os sintomas, apresentem também menos efeitos colaterais se comparados aos fármacos já existentes. Este projeto tem como objetivo avaliar o possível efeito antidepressivo de recém-sintetizadas 1,2,3-triazoil-acetofenonas, através de estudos pré-clínicos. A partir de testes de docagem molecular, serão selecionadas as moléculas com maior probabilidade de inibição sobre as enzimas MAO-A e/ou MAO-B para testes in vitro de inibição destas enzimas. A molécula com maior efeito inibitório sobre a MAO-A e/ou MAO-B in vitro será utilizada para os testes in vivo. O efeito do tipo antidepressivo da 1,2,3-triazoil-acetofenona selecionada será avaliado através dos testes do nado forçado (TNF), suspensão da cauda (TSC) e teste do campo aberto (TCA) em camundongos. Inicialmente será realizada uma curva de dose-resposta da 1,2,3-triazoil-acetofenona selecionada nos testes de suspensão da cauda (TSC) e nado forçado (TNF), para avaliar seu efeito do tipo antidepressivo. Posteriormente, será realizada uma curva de tempo-resposta da 1,2,3-triazoil-acetofenona selecionada no TSC. O TCA será realizado previamente aos TNF e TSC, para avaliação da atividade locomotora dos animais. A fluoxetina será utilizada como controle positivo. Para avaliar o envolvimento do sistema serotoninérgico no efeito do tipo antidepressivo da 1,2,3-triazoil-acetofenona, diferentes grupos de animais serão tratados com antagonistas dos receptores serotoninérgicos 5-HT1A, 5-HT2A/2C e 5-HT3, bem como o inibidor da síntese de 5-HT, p-clorofenilalanina (p-CPA), antes da administração da 1,2,3-triazoil-acetofenona. Posteriormente, o comportamento dos animais será avaliado no TSC. Diferentes grupos de animais serão tratados com uma dose efetiva da 1,2,3-triazoil-acetofenona e então a atividade da MAO cerebral (A e B) será avaliada ex vivo. Por fim, será realizado um teste de toxicidade da 1,2,3-triazoil-acetofenona em camundongos fêmeas após uma dose elevada de 300 mg/kg, onde será observada a letalidade até 14 dias e os níveis plasmáticos de AST, ALT e ureia. Espera-se com este projeto encontrar uma nova droga com efeito do tipo antidepressivo.

Objetivo Geral

O objetivo geral deste projeto é avaliar o efeito do tipo antidepressivo de 1,2,3-triazoil-acetofenonas em camundongos.

Justificativa

A depressão é um problema de saúde grave e que acomete uma parcela significativa da população mundial, visto que cada vez mais as pessoas sofrem com os sintomas da doença e com o impacto que estes causam nas relações sociais dessas pessoas. A depressão é um conjunto heterogêneo de estados psíquicos, que se apresentam como tristeza e incapacidade de sentir prazer. Indivíduos que apresentam a doença podem apresentar diferentes sintomas e origem dos mesmos.

Na depressão, segundo os critérios diagnósticos do episódio depressivo maior pelo DSM-IV (Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders), deve haver obrigatoriamente presença de humor depressivo ou perda de interesse ou prazer durante pelo menos duas semanas, além de uma série de outros sintomas relacionados, tais como alterações psicomotoras e de sono, redução no grau de concentração, variação de peso corporal e perda de energia (Vismari et. al , 2008).

De acordo com estudos epidemiológicos, a prevalência de depressão ao longo da vida no Brasil está em torno de 15,5% da população. Segundo a Organização Mundial da Saúde (OMS), a prevalência de depressão na rede de atenção primária de saúde é 10,4%, isoladamente ou associada a um transtorno físico. Também segundo a OMS, a depressão situa-se em 4º lugar entre as principais causas de ônus, respondendo por 4,4% dos ônus acarretados por todas as doenças durante a vida. Ocupa 1º lugar quando considerado o tempo vivido com incapacitação ao longo da vida (11,9%). Segundo Cunha et al. (2012), a depressão está mais acentuadamente associada a certas características sociais, como a baixa escolaridade, o desemprego e o baixo nível econômico, de acordo com o sistema de classificação da Associação Brasileira de Institutos de Pesquisa de Mercado.

A serotonina (5-HT) é uma monoamina encontrada na região periférica do organismo, principalmente nas plaquetas e em uma quantidade menor como neurotransmissor, no Sistema Nervoso Central (SNC). A 5-HT tem efeito inibidor, aliado a um efeito modulador geral da atividade psíquica. Através da inibição ou estimulação do ácido gama-aminobutírico (GABA), ela regula muitas das funções do cérebro humano. Com seu mecanismo de ação a nível cerebral, a 5-HT regula o humor, o sono, a atividade sexual, o apetite, o ritmo circadiano, as funções neuroendócrinas, a temperatura corporal, a sensibilidade à dor, a atividade motora e as funções cognitivas (Rossi and Tirapegui, 2004). Um déficit na quantidade desse neurotransmissor pode levar ao desenvolvimento de sintomas depressivos (David and Gardier, 2016).

Conforme Bittencourt (2013), a primeira classe de medicamentos antidepressivos a ser desenvolvida foram os inibidores da enzima monoamino oxidase. A monoamina oxidase (MAO) é uma enzima localizada na membrana mitocondrial externa de algumas células. O cofator flavina-adenosina-dinucleotídeo (FAD) é quem catalisa a desaminação oxidativa de monoaminas endógenas ou exógenas através de uma sequência de reações. Entre os substratos da MAO, estão os neurotransmissores monoaminérgicos. A MAO apresenta-se como duas isoformas distintas, chamadas MAO-A e MAO-B, que diferem entre si pela especificidade ao substrato e inibição (Folmer and Netto, 2013).

Uma atividade anormal da isoforma MAO-B está relacionada a várias desordens neurológicas, como doença de Parkinson e doença de Alzheimer, enquanto a isoforma MAO-A parece estar associada com condições psiquiátricas como depressão e ansiedade (Youdim and Bakhle, 2006). Muitos dos IMAO utilizados clinicamente são irreversíveis, ou seja, ligam-se de forma covalente à enzima, inativando-a totalmente, o que resulta em efeitos colaterais, principalmente pelo fato de interagirem com fármacos simpatomiméticos.

Os medicamentos que inibem a recaptação de 5-HT ou inibem a MAO, permitindo que a 5-HT permaneça em maior quantidade e por um tempo maior na fenda sináptica, promovem ações direta no controle das emoções, por isso são utilizados no tratamento da depressão (Feijó; Bertolucci; Reis, 2011). No entanto, todos os antidepressivos atualmente disponíveis no mercado apresentam inúmeras limitações, como lento início de ação e muitos efeitos colaterais (Páez-Pereda, 2005).

Recentemente foi sintetizado uma nova classe de compostos 1,2,3-triazoil-acetofenonas, com a finalidade de testá-las pré-clinicamente em modelos de depressão em roedores. Dessa forma, a proposta deste projeto justifica-se pela necessidade de desenvolver novas ferramentas farmacológicas com potencial terapêutico para a depressão, a qual é uma doença que ainda necessita de tratamentos mais eficazes.

Metodologia

Teste de docagem molecular

As 1,2,3-triazoil-acetofenonas (17 moléculas) serão avaliadas inicialmente em um estudo de docagem molecular frente a possível inibição da MAO-A e ou MAO-B. As 4 moléculas com maior probabilidade de inibição destas enzimas serão escolhidas para o teste in vitro da atividade da MAO-A e B.



Teste in vitro

Efeito das 1,2,3-triazoil-acetofenonas na atividade da monoamino-oxidase (MAO) in vitro

O efeito das 1,2,3-triazoil-acetofenonas (4 moléculas selecionadas) na atividade da MAO-A e B in vitro será avaliado conforme Krajl (1965), em preparado de mitocôndrias de cérebro de camundongo, conforme Soto-Otero e cols. (2001).


Reversibilidade da inibição da atividade da monoamino-oxidase (MAO) in vitro

A reversibilidade da inibição da atividade da MAO-A e B pelas 1,2,3-triazoil-acetofenonas será determinada utilizando a concentração das 1,2,3-triazoil-acetofenonas que inibe 50 % da atividade da enzima (CI50), conforme Sampaio e cols. (2016).


Cinética de inibição da monoamino-oxidase (MAO) in vitro

A cinética enzimática de inibição da MAO-A e B será realizada utilizando diferentes concentrações do substrato e das 1,2,3-triazoil-acetofenonas, conforme Sampaio e cols. (2016).



Testes comportamentais

Baseado nos testes de docagem molecular, atividade da MAO in vitro, reversibilidade e cinética de inibição, uma 1,2,3-triazoil-acetofenona será selecionada para os testes in vivo em camundongos. Serão realizados os testes de suspensão da cauda (TSC) e teste do nado forçado (TNF) para avaliar o efeito do tipo antidepressivo da mesma e o teste do campo aberto, para avaliação da atividade locomotora dos animais.

Teste de suspensão da cauda (TSC)

Neste teste serão realizadas uma curva dose-resposta e uma curva tempo-resposta para avaliação da atividade do tipo antidepressiva da 1,2,3-triazoil-acetofenona. Para a curva dose-resposta, os animais serão tratados pela via intragástrica com diferentes doses da 1,2,3-triazoil-acetofenona selecionada (1, 10 e 50 mg/kg) e após 30 min (tempo no qual muitos antidepressivos, como a fluoxetina, apresentam efeito do tipo antidepressivo no TSC) o TSC será realizado, conforme Steru et al. (1985). A fluoxetina será utilizada como controle positivo, na dose de 20 mg/kg, i.p.. Para a curva tempo-resposta, os animais serão tratados pela via intragástrica com uma dose efetiva da 1,2,3-triazoil-acetofenona no TSC e após diferentes tempos (15 min, 30 min, 1h e 2 h) o TSC será realizado.

Teste do nado forçado (TNF)

Os animais serão tratados pela via intragástrica com diferentes doses da 1,2,3-triazoil-acetofenona (1, 10 e 50 mg/kg) ou veículo e após 30 min (tempo no qual muitos antidepressivos, como a fluoxetina, apresentam efeito do tipo antidepressivo no TNF) , o TNF será realizado, conforme Porsolt et al. (1977). A fluoxetina será utilizada como controle positivo, na dose de 20 mg/kg.

Teste do campo aberto

A fim de descartar qualquer efeito de um possível déficit locomotor causado pelos tratamentos nos testes de comportamento depressivo, imediatamente antes de cada teste comportamental os camundongos serão avaliados no teste do campo aberto, conforme Walsh e Cummins, 1976.

O papel do sistema serotoninérgico no efeito do tipo antidepressivo da 1,2,3-triazoil-acetofenona

Para avaliar a contribuição do sistema serotoninérgico no efeito do tipo antidepressivo da 1,2,3-triazoil-acetofenona selecionada, diferentes grupos de animais serão pré-tratados com os antagonistas serotoninérgicos WAY100635 (antagonista do receptor 5-HT1A, 0,1 mg/kg, s.c.), quetanserina (antagonista do receptores 5-HT2A/2C, 4 mg/kg, i.p.) ondansetrona (antagonista 5-HT3, 1 mg/kg, i.p.) e p-clorofenilalanina (inibidor da síntese de serotonina, 100 mg/kg, i.p., por três dias consecutivos). 15 min após a administração dos antagonistas a 1,2,3-triazoil-acetofenona na dose com melhor efeito no TSC será administrada via intragástrica, e após o melhor tempo da curva tempo-resposta o TSC será realizado.


Teste ex vivo

Atividade da monoamino-oxidase ex vivo

Os animais serão tratados com uma dose da 1,2,3-triazoil-acetofenona com melhor efeito nos testes de comportamento depressivo ou veículo. Após o melhor tempo da curva dose-resposta os animais serão mortos por excesso de isoflurano e a atividade da MAO será avaliada conforme Krajl (1965), em preparado de mitocôndrias de cérebro total, conforme Soto-Otero e cols. (2001).

Teste de toxicidade

Para avaliar a possível toxicidade da 1,2,3-triazoil-acetofenona, camundongos fêmeas receberão uma única dose oral dos compostos selecionados na dose de 300 mg/kg ou veículo conforme indicado pelas diretrizes da OECD (423, 17 de dezembro de 2001). Serão utilizadas fêmeas com jejum de 3-4h antes da administração e com variação de no máximo 20% do peso corporal, conforme preconizado pela OECD. Os animais serão observados a cada 30 min durante as primeiras 24h e depois diariamente por 14 dias (OECD) para determinar o potencial letal dos compostos.



Após o teste de toxicidade recomendado pela OECD, os camundongos serão anestesiados para o procedimento de punção cardíaca e o sangue será coletado em tubos contendo heparina. O plasma será obtido após centrifugação e usado para ensaios bioquímicos através de kits comerciais. As atividades da aspartato aminotransferase (AST) e alanina aminotransferase (ALT) no plasma serão usadas como indicadores de função hepática (Reitman and Frankel, 1957). A função renal será avaliada pelos níveis plasmáticos de ureia (Mackay and Mackay, 1927). Amostras hemolisadas serão descartadas.

Indicadores, Metas e Resultados

Espera-se com este projeto indicar uma nova molécula com possível efeito do tipo antidepressivo, bem como contribuir com a formação de alunos de iniciação científica e de pós-graduação da UFPel.

Equipe do Projeto

NomeCH SemanalData inicialData final
CAMILA SIMÕES PIRES
CESAR AUGUSTO BRUNING4
CLEISSON SCHOSSLER GARCIA
CRISTIANI FOLHARINI BORTOLATTO2
DIEGO DA SILVA ALVES1
EVELYN MIANES BESCKOW
GUSTAVO D'AVILA NUNES
KAUANE NAYARA BAHR LEDEBUHR
MARCELO HEINEMANN PRESA
MARCIA JUCIELE DA ROCHA
MARCOS PIZZATTO DE AZEREDO
NARRYMAN PINTO ZUGE
Pabliane Rodrigues Garcia

Fontes Financiadoras

Sigla / NomeValorAdministrador
CAPES / Coordenação de Aperfeiçoamento de Nível SuperiorR$ 4.000,00Coordenador

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