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Roundup é um herbicida de amplo espectro que atua na via do shikimato, inibindo a biossíntese de aminoácidos essenciais de plantas. Esse herbicida contém glifosato como ingrediente ativo e polioxietileno amina como surfactante. No sul do Brasil, Roundup é amplamente utilizado nas monoculturas de arroz e de soja nos campos sulinos do entorno da Lagoa Mirim. Nessa área, alguns agricultores usam sobredoses de Roundup objetivando a diminuição das perdas por volatilização e/ou derivação para espécies não-alvo, além de não respeitarem os períodos de carência do produto. O Roundup possui alta solubilidade em água e alcança corpos d’água naturais, o que faz animais aquáticos estarem expostos a este composto. Vários estudos mostram os efeitos adversos causados por Roundup sobre sistemas orgânicos de peixes, dentre os quais destaca-se o sistema reprodutor. A Organização Mundial da Saúde (OMS) classifica o Roundup como um carcinogênico em potencial, interferindo também na fisiologia do sistema reprodutor. Já foi reportado que o Roundup atua no sistema endócrino, diminuindo a fertilidade, desregulando a esteroidogênese e alterando a qualidade e motilidade espermáticas em peixes expostos a esse contaminante ambiental. Efeitos deletérios reprodutivos geram maior preocupação, pois põem em risco não apenas a população atual de determinada espécie, mas também as populações futuras. Espécies que dependem de eventos reprodutivos únicos e/ou curtos podem estar fadadas a um declínio populacional e até mesmo à extinção. As espécies de peixes-anuais se enquadram exatamente nessa situação. Peixes-anuais são Cyprinodontiformes das famílias Rivulidae e Aplocheilidae dulciaquícolas de curto ciclo de vida que ocupam ambientes extremamente efêmeros, como poças temporárias que secam durante a estação seca, o que leva a totalidade da população adulta à morte. Durante a estação chuvosa, os adultos reproduzem e geram embriões resistentes à dessecação. Esses embriões permanecem enterrados no fundo seco e eclodem na próxima estação chuvosa, quando as poças novamente se alagam. Os juvenis recém-eclodidos crescem e atingem a maturidade sexual em poucas semanas e um novo ciclo reprodutivo se inicia.
Dentre os peixes-anuais Neotropicais, a espécie mais estudada é Austrolebias charrua, que se distribui do sul do Brasil até o leste do Uruguai. Assim como várias outras espécies de peixes-anuais, A. charrua é uma espécie endêmica e ameaçada de extinção. Os fatores determinantes para essa ameaça iminente no Brasil são a perda de habitat, distribuição restrita e baixa capacidade de dispersão. Em vista do curto período disponível para acasalamento e de os habitats naturais estarem sendo invadidos por monoculturas dependentes do uso de Roundup, é extremamente preocupante a hipótese de os eventos reprodutivos de A. charrua e dos rivulídeos em geral já não estejam sendo tão produtivos quanto outrora. Para investigar essa possibilidade pretende-se realizar a identificação e sequenciamento de genes envolvidos na esteroidogênese e caracterizar seus perfis de expressão em resposta à exposição ao glifosato e ao Roundup. Além disso, propõe-se a avaliação morfológica das gônadas e dos embriões e análises bioquímicas e de qualidade espermática dos gametas masculinos. Ademais propõe-se a identificação, sequenciamento, análise da expressão e avaliação de miRNAs como marcadores de toxicidade reprodutiva em A. charrua. Os resultados obtidos através desta proposta podem impactar diretamente em diversos âmbitos da sociedade. Esses impactos seriam no âmbito científico, através do conhecimento gerado sobre o cultivo e a biologia básica da espécie, ou seja, ciência básica e aplicada; no âmbito legal, através dos subsídios para alteração de legislação e geração de novas ferramentas de perícia e monitoramento ambiental; e no âmbito da saúde única, que une os conceitos de saúde humana, saúde animal e saúde ambiental, através da possibilidade de diminuição de glifosato na água.

Coleta e desenho experimental: 112 machos e 112 fêmeas de A. charrua serão coletados e transportados até o Biotério Aquático da FURG, onde serão aclimatados e distribuídos 8 casais por tanque. O experimento contará com grupos controle, glifosato e Roundup (0,065; 5 e 10 mg/L). A exposição ocorrerá por 24h.
Os ovos embrionados serão recolhidos para análises morfológicas. Os animais serão submersos em solução de 400 mg/L de tricaína para eutanásia, biometria e coleta de tecidos. Ovários de 2 fêmeas por tanque serão armazenados em solução de Bouin para histologia, e testículos de 2 machos por tanque serão armazenados em BTS para análise espermatica. As gônadas dos animais restantes serão armazenadas em nitrogênio líquido para extração de RNA.
Análises dos embriões e gônadas : Os embriões coletados serão contabilizados, medidos e avaliadas possíveis alterações morfológicas. As gônadas de todos os animais serão medidas e os índices gonadossomáticos serão calculados. Os tecidos ovarianos serão emblocados em parafina, feitas microsecções e corados com hematoxilina/eosina para posterior avaliação sob microscopia.
Análise de qualidade espermática: O sêmen presente nos testículos será ativado através da diluição em solução de ativação. A amostra será adicionada em uma lâmina padrão para a determinação dos parâmetros cinéticos através do uso do sistema computer-assisted sperm analysis. Serão avaliados 500 espermatozoides por amostra.
Citometria de fluxo: As análises por citometria serão em equipamento Attune® Acoustic Focusing Flow Cytometer. Serão avaliadas: integridade de membrana; fluidez de membrana; funcionalidade mitocondrial; produção de EROS; e peroxidação lipídica.
Extração, quantificação do RNA e confecção do cDNA: As amostras coletadas terão RNA extraído através do kit RNeasy® Mini Kit. O RNA será quantificado e avaliado quanto à sua pureza. Para a confecção do cDNA será utilizado o kit High Capacity cDNA Reverse Transcription em termociclador SimpliAmp™.
Desenho dos primers: Serão realizados alinhamentos de sequências gênicas conhecidas e depositadas no Genbank®, a fim de identificar regiões conservadas para identificação dos genes em A. charrua, utilizando a ferramenta PriFi. Serão buscados 18 genes, ainda nõ descritos na espécie.
Amplificação, clonagem e sequenciamento dos fragmentos gênicos: Será utilizado o mix buffer GoTaq®; o cDNA confeccionado; e os primers engenheirados para amplificação. Os parâmetros de incubação ainda são incertos, uma vez que tais genes ainda não foram sequenciados. A amplificação será confirmada por eletroforese em gel de agarose. Os produtos de PCR serão inseridos em vetor pCR™4-TOPO®, bactérias Escherichia coli serão transformadas, cultivadas, e o vetor será isolado e purificado utilizando o kit Illustra plasmidPrep. As amostras serão sequenciadas por método de Sanger automatizado, com auxílio do kit BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing e BigDye® XTerminator™ Purification. O sequenciamento ocorrerá em equipamento Applied Biosystems 3500 Genetic Analyzer®.
Análise da expressão gênica por qRT-PCR: As reações de qRT-PCR ocorrerão no equipamento Stratagene® Mx3005P™ Real-Time PCR System e serão preparadas usando o mix SYBR® Green. Os dados obtidos serão analisados usando o método de 2-ΔΔCt.
Isolamento, construção da biblioteca e sequenciamento de miRNAs: Os miRNA serão isolados com o kit NEBNext® Small RNA Library Prep e a concentração e integridade das amostras serão avaliadas. As bibliotecas de miRNAs serão analisadas antes do sequenciamento na plataforma MiSeq Illumina.
Análise in silico, anotação funcional e validação da expressão diferencial de miRNAs: O alinhamento das sequências e a quantificação dos miRNAs será feito em sRNAtoolbox. A análise de expressão diferencial dos miRNAs será realizada usando pacote edgeR. Para validar a expressão diferencial de miRNA serão realizadas reações de qPCR, utilizando primers específicos para os miRNA diferencialmente expressos entre os grupos.

Os resultados desta proposta poderão ser divididos em dois grandes grupos de dados: (i) os resultados de identificação, sequenciamento expressão de genes; (ii) e os resultados de identificação, sequenciamento expressão de miRNAs. Estes resultados abastecerão o corpo de dados referentes à biologia geral e de criação em cativeiro de A. charrua, que está entre as espécies-chave para acompanhamento e proteção dos rivulídeos ameaçados de extinção, segundo o Instituto Chico Mendes de Conservação da Biodiversidade (ICMBio). Ainda, a presente proposta fará o primeiro sequenciamento de vários genes dessa espécie, aumentando e disponibilizando para o público o conhecimento sobre o patrimônio genético nacional.
Espera-se que ao final dos experimentos os resultados gerem subsídios para que a legislação brasileira, uma das mais permissivas do mundo quanto à contaminação ambiental por glifosato, restrinja, ou pelo menos não amplie, as concentrações desses produtos permitidas no ambiente natural. Além disso, os miRNAs identificados têm potencial para serem utilizados como marcadores de intoxicação dos peixes-anuais expostos a herbicidas à base de glifosato e contaminação ambiental, o que representaria uma nova ferramenta de reconhecimento da qualidade e saúde ambiental.
Ainda, espera-se que esta proposta gere, pelo menos, a publicação de dois artigos científicos em periódicos internacionais com alto fator de impacto, assim como já vêm sendo praticado por todos os colaboradores nos últimos anos, além do depósito em banco de dados internacional da sequência de todos os genes obtidas durante o desenvolvimento da presente proposta. Também se tem a expectativa da realização de um depósito de pedido de patente junto ao Instituto Nacional de Propriedade Industrial (INPI) referente ao método de detecção de intoxicação de peixes-anuais por herbicidas à base de glifosato e de contaminação ambiental por esses produtos.
A previsão da completa obtenção e entrega dos produtos supracitados dar-se-á da seguinte forma: o primeiro dos dois artigos será submetido para apreciação de revista especializada no tema durante o 1º ano de vigência do projeto. O segundo artigo terá sua submissão realizada durante o 2º ano de vigência do projeto, assim como o depósito de pedido de patente no INPI.