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No Brasil, a lagarta-do-cartucho, Spodoptera frugiperda (J. E. Smith 1797), é considerada a espécie mais destrutiva do milho (Zea mays L.) (CRUZ et al., 2012). O controle desta espécie na cultura do milho foi por muito tempo, realizado quase que exclusivamente pelo uso de inseticidas químicos sintéticos. Entretanto, o controle químico de S. frugiperda em milho é dificultado pelo comportamento larval desta espécie, a qual tem o hábito de se alojar no interior do “cartucho” da planta, dificultando o que inseticida de atingir o alvo de controle (CARVALHO et al., 2013). Além disso, o uso generalizado de inseticidas, por muitas vezes de forma indiscriminada, também contribuiu para a evolução da resistência de S. frugiperda aos principais inseticidas utilizados para seu controle, dificultando ainda mais o manejo desta espécie em milho (DIÉZ-RODRÍGUEZ; OMOTO, 2001).
Em 2012, o Insecticide Resistance Action Committee (IRAC) definiu resistência como uma mudança hereditária na suscetibilidade de uma população da praga que se reflete na falha repetida de um produto de atingir o nível de controle esperado, quando utilizado de acordo com a recomendação do rótulo para determinada espécie praga. Atualmente, mais de 20 ingredientes ativos apresentam relatos de resistência em S. frugiperda em todo mundo (ARTHROPOD PESTICIDE RESISTANCE DATABASE, 2016 - https://www.irac-online.org/publishers/arthropod-pesticide-resistance-database/). No Brasil, foram reportados casos de resistência de S. frugiperda a lambdacialotrina (DIEZ-RODRÍGUEZ; OMOTO, 2001), clorpirifós (CARVALHO et al., 2013), lufenurom (NASCIMENTO et al., 2016), espinosade (OKUMA et al., 2018) e diamidas (BOLZAN et al., 2019).
No Brasil, a partir de 2007, houve a liberação comercial de eventos de milho transgênicos que expressam proteínas inseticidas de Bacillus thuringiensis Berliner (Bt), os quais representaram uma nova tática para o controle de S. frugiperda. Nos anos seguintes, o uso dessas estratégias de controle aumentou gradativamente, ocupando atualmente mais de 12 milhões de hectares/ano, o que equivale a mais de 95% da área ocupada pela cultura do milho no Brasil (CÉLERES, 2018), configurando-se na principal tática de controle de S. frugiperda no Brasil (OKUMURA et al., 2013; WAQUIL et al., 2013; BERNARDI, D. et al., 2015; SORGATTO et al., 2015). O uso desta tática de controle de S. frugiperda tem contribuído para a redução da utilização de inseticidas em milho (KLÜMPER; QAIM, 2014), proporcionando uma produção mais sustentável e corroborando potencialmente para o restabelecimento da suscetibilidade a inseticida em populações S. frugiperda (MARTINELLI; OMOTO, 2005), bem como, na preservação dos inimigos naturais desta espécie (LU et al., 2012; COMAS et al., 2014).
Contudo, a adoção contínua de milho Bt para controle de S. frugiperda expôs as populações da praga a uma intensa pressão de seleção, favorecendo a evolução da resistência (MCGAUGHEY, 1992). Apesar da disponibilidade de diversas tecnologias de milho Bt para cultivo comercial, a maioria expressa proteínas inseticidas do grupo Cry1 (HERNANDEZ-RODRIGUEZ et al., 2013; VÉLEZ et al., 2013). Várias proteínas desse grupo apresentam resistência cruzada, tais como Cry1F, Cry1A.105, Cry1Ac e Cry1Ab (HERNANDEZ-RODRIGUEZ et al., 2013; VÉLEZ et al., 2013; HUANG et al., 2014; BERNARDI, D. et al., 2015; OMOTO et al., 2016). No Brasil, S. frugiperda desenvolveu resistência para proteína Cry1F expressa em milho Herculex™ em menos de quatro anos (FARIAS et al., 2014; SANTOS-AMAYA et al., 2015) e para Cry1Ab expressa em milho MON810 (OMOTO et al., 2016). Também foi reportada a resistência de S. frugiperda ao milho Cry1F em Porto Rico e nos Estados Unidos da América (STORER et al., 2010; HUANG et al., 2014). No Brasil, estudos recentes reportaram a seleção em laboratório a partir de populações de campo de linhagens resistentes de S. frugiperda ao milho YieldGard VT PRO™ que expressa Cry1A.105/Cry2Ab2 (BERNARDI, D. et al., 2015; SANTOS-AMAYA et al., 2015), PowerCore™ que expressa Cry1A.105/Cry2Ab2/Cry1F (BERNARDI, D. et al., 2016; HORIKOSHI et al., 2016), Agrisure Viptera™ e Agrisure Viptera™ 3 expressando Vip3Aa20 e Vip3Aa20/Cry1Ab, respectivamente (BERNARDI, O. et al., 2016).
Frente a este cenário, estratégias alternativas de manejo da lagarta-do-cartucho devem ser estudadas. A utilização de biopesticidas a base de virus entomopatogênicos e inimigos naturais (parasitóides e predadores) podem ser alternativas sustentáveis para incorporar dentro dos programas de Manejo Integrado de Pragas (MIP) (MOSCARDI, 1999; BUENO et al., 2012), principalmente, com os avanços na produção e formulação de produtos à base de baculovírus (MOSCARDI, 1999) e desenvolvimento de técnicas de criação de parasitoides em grande escala (PARRA; COELHO, 2019).
No Brasil, durante a década de 1980, o uso de o baculovírus Anticarsia gemmatalis NPV múltiplo (AgMNPV) em soja foi reconhecida mundialmente por seu sucesso no manejo biológico do inseto (MOSCARDI, 1999). O baculovírus AgMNPV foi aplicado para mais de um milhão de hectares por ano para o controle de Anticarsia gemmatalis Hübner (Lepidoptera: Erebidae) (MOSCARDI, 1999). Entretanto, o uso de AgMNPV diminuiu ao longo do tempo devido a introdução de inseticidas químicos altamente eficazes para seu controle (TAY et al., 2013; KUSS et al., 2016). O uso de baculovírus nos programas de MIP destaca-se como um ferramenta alternativa de manejo devido à sua elevada eficácia, seletividade a insetos não-alvo e segurança para os seres humanos e/o meio ambiente (MOSCARDI, 1999, BEAS-CATENA et al., 2014). Atividade biológica de inseticidas a base de virus tem sido relatados para diferentes pragas agrícolas, como H. armigera em algodão, soja e tomate (Solanum lycopersicum L.) (KUSS et al., 2016;), S. frugiperda em milho e arroz (Oryza sativa L.) (HARRISON et al., 2008), Spodoptera exigua (Hübner) (Lepidoptera: Noctuidae) em horticultura (CABALLERO et al., 2009), e A. gemmatalis e C. includens em soja (MOSCARDI, 1999; CRAVEIRO et al., 2015) e espécies do gênero heliothine (LITTLE et al., 2019).
No Brasil, com a adoção promissora do vírus entomopatogênico Cartugem™ (SfMNPV: Baculoviridae: Alphabaculovirus) - um inseticida com um novo modo de ação (Grupo 31, Comitê de Ação de Resistência a Inseticidas - IRAC), com registro para o uso no manejo de S. frugiperda na cultura do milho, pode ser uma alternativa eficaz para o manejo da resistência de S. frugiperda a tecnológicas de milho Bt. Embora, o vírus SfMNPV ser caracterizado com alta especificidade e potencial para uso em no manejo de S. frugiperda (BARRERA et al., 2011) e elevada toxicidade em lagartas da espécie em laboratório (BENTIVENHA et al., 2018), sua introdução para uso em larga escala comercial para o manejo populações de S. frugiperda resistentes a tecnologia de milho Bt devem ser avaliadas para delinear o posicionamento correto desta alternativa de controle.
Associado a essas estratégias de manejo (plantas Bt e vírus entomopatogênicos), a utilização do controle biológico para o manejo de lepidópteros merece atenção especial (PARRA; COELHO, 2019). No Brasil, a utilização de parasitoides de ovos do gênero Trichogramma é considerado o maior programa de controle biológico de pragas do mundo (PARRA; COELHO, 2019). Para S. frugiperda, destaca-se o parasitoide de ovos Telenomus remus Nixon (Hymenoptera: Platygastridae) (BUENO et al., 2008; POMARI et al. 2012). A eficiência deste parasitoide deve-se à sua habilidade de parasitar todas as camadas de ovos da postura, sendo que cada fêmea pode dar origem a aproximadamente 270 novos indivíduos (MORALES et al., 2000).
Devido ao elevado potencial biótipo e capacidade de parasitismo da espécie em ovos de S. frugiperda, a utilização de T. remus para o manejo da lagarta-do-cartucho parece ser uma solução viável perante a situação complicada de manejo da praga, principalmente, se as estratégias sugeridas no presente estudo (associação de plantas Bt, virus entomopatogênicos e parasitoides de ovos) demonstrarem compatibilidade para o uso conjunto. Contudo, para que isso seja possível, torna-se indispensável o conhecimento biológico de T. remus em ovos de S. frugiperda resistentes a tecnologias de milho Bt, uma vez com que a mudança na suscetibilidade genética da S. frugiperda as tecnologias de milho Bt para ocorrer a evolução da resistência pode acarretar em efeitos negativos no desenvolvimento biológico do inimigo natural. Desta forma, a determinação do comportamento biológico do parasitoides sobre os ovos de linhagens de S. frugiperda resistentes será determinante para o sucesso no manejo da lagarta-do-cartucho com a utilização do parasitoide. De posse do exposto, o presente projeto objetiva estudar diferentes estratégias de manejo isoladas e associadas de S. frugiperda mediante o uso de milho Bt, vírus entomopatogênico e T. remus. A determinação do posicionamento correto da associação dessas três estratégias de manejo é de fundamental importância para o manejo da resistência de S. frugiperda a campo.

Efeito letal e subletal de vírus entomopatogênico em linhagens de S. frugiperda em laboratório

Para avaliar o efeito letal será utilizado a dose (Tratamento 1) do vírus Cartugen™ recomendada pelo fabricante do produto (Cartugen™ - 200 mL do produto comercial por 150 Litros de água). Em contraste, para avaliar os efeitos subletais, será utilizado 50% da dose (Tratamento 2) recomendada pelo fabricante do produto (Cartugen™ - 100 mL do produto comercial por 150 Litros de água). Para tanto, plantas de milho Herculex™ (H), YieldGard VT PRO™ (VT), PowerCore™ (PW) e isolinhas não-Bt, serão cultivadas em casa de vegetação em vaso plástico (1 planta/vaso) de 10L contendo terra e substrato vegetal na proporção de 1:1. Os tratos culturais serão adotados de acordo com a recomendação para a cultura. No estágio fenológico V6, as plantas de milho Bt e não-Bt serão pulverizadas com os tratamentos utilizando um volume de calda de 150L por hectare. A pulverização será realizada com auxilio de câmera de pulverização automática III Pulverizador, Hollandale, MN, EUA), equipado com pontas de bicos tipo ventilador XR 110.02 (Teejet Technologies, Glendale Heights, Illinois, IL, EUA). Após 4 h da aplicação, folhas de milho (Bt e não-Bt) serão retiradas do terço superior da planta e, em laboratório, cortadas em pedaços de 5 cm2. Posteriormente, serão acondicionados em placas de bioensaio com 16 células (5,5 centímetros de comprimento x 4,0 cm de profundidade × 3,0 centímetros de altura por poço) sobre uma mistura não-geleificada de ágar-água (2,5%). As folhas de milho serão separadas da camada de ágar-água por um papel filtro. Feito isso, com o auxílio de um pincel fino, neonatas de S. frugiperda com até 24 h de idade das linhagens de S. frugiperda (linhagem Res, Sus e Het), provenientes de milho Bt, não-Bt e dos cruzamentos recíprocos (Tabela 1) serão inoculadas (1 lagarta por célula) de acordo com o tratamento (concentração de produto) utilizado. Como controle negativo (Testemunha) para cada linhagem de S. frugiperda avaliada (Tabela 1) serão utilizados plantas de milho Bt ou não-Bt sem a aplicação de virus. Após a inoculação, as placas serão acondicionadas em câmara climatizada a 27 ± 1°C, umidade relativa 60 ± 10% e fotofase de 14 h. O delineamento experimental será inteiramente casualizado com 10 repetições, sendo cada repetição constituída de 16 lagartas, totalizando 160 neonatas/linhagem. A mortalidade das lagartas será avaliada diariamente e as lagartas sobreviventes de cada tratamento (letal ou subletal) serão resgatadas e alimentadas com o respectivo alimento natural de acordo com a linhagem de S. frugiperda avaliada, até a fase de pupa e emergência de adultos. Os parâmetros biológicos avaliados serão: duração e viabilidade das fases de larva, pupa, peso de pupas com 24 h de idade, razão sexual, longevidade de fêmeas, período de oviposição e número de ovos por fêmea. A razão sexual será calculada pela fórmula: rs = ♀ / (♂+♀). A duração e a viabilidade das fases de larva, pupa serão determinadas em observações diárias. A longevidade e o número de ovos por fêmea serão avaliados a partir da formação de 20 casais/linhagem ou cruzamento em gaiolas de PVC (23 cm altura × 10 cm de diâmetro), revestidas internamente com folha de papel jornal (substrato de oviposição) e fechadas na parte superior com tecido “voile”. Diariamente, será contado o número de ovos e será registrado a mortalidade dos adultos. Para determinação do período embrionário e viabilidade de ovos, serão obtidos  100 ovos da segunda postura de cada casal. Os ovos serão acondicionados em tubos de vidro de fundo chato (8,5 × 2,5 cm). No interior dos tubos será colocado um pedaço de papel filtro (2 × 1 cm), o qual será umedecido diariamente com água destilada, sendo fechados na parte superior com filme plástico. As posturas serão observadas diariamente contando-se o número de lagartas eclodidas. A duração das fases de ovo, lagarta, pupa e período ovo-adulto, biomassa de pupas, período de pré-oviposição, oviposição e pós-oviposição (x) serão transformados em arcsen √(x+0,5). Posteriormente, os dados serão submetidos à análise de variância e as médias comparadas pelo teste t (P ≤ 0.05) (PROC TTEST, SAS INSTITUTE, 2011). O possível desvio na proporção dos sexos será comparado utilizando o teste de Qui-quadrado (χ2) (P ≤ 0,05) (PROC FREQ, SAS INSTITUTE, 2011). Adicionalmente será calculada a tabela de vida de fertilidade estimando-se o intervalo médio entre gerações (T), a taxa líquida de reprodução (Ro), a taxa intrínseca de crescimento (rm) e a razão finita de crescimento (λ). Os parâmetros da tabela de vida de fertilidade e respectivos erros padrão serão estimados pelo método "Jackknife" usando "Lifetable.sas" (MAIA et al., 2000) e comparados pelo teste t bilateral (P ≤ 0.05) pelo software SAS™ (SAS INSTITUTE, 2011).

Suscetibilidade de linhagens de S. frugiperda resistentes e suscetíveis a milho Bt com a utilização de virus em casa de vegetação

Para realização dos estudos, serão utilizados o milho Herculex (H), YieldGard VT PRO™ (VT), PowerCore™ (PW) e respectivas isolinhas não-Bt, os quais serão semeados em casa de vegetação em vasos plásticos de 10L (4 sementes/vaso), conforme descrito anteriormente. Será avaliado o efeito da utilização de virus (dose recomendada pelo fabricante) em lagartas de 1º e 3º instar larval de todas as linhagens de S. frugiperda (Tabela 1). Para tanto, plantas de milho Bt e não- Bt no estádio fenológico V6, serão infestadas com lagartas de 1º ou 3º instar larval das linhagens de S. frugiperda em cada hibrido de milho correspondente (Tabela 1) (3 lagartas/planta). Decorrido 24 horas após a infestação será realizada a pulverização de virus na dose comercial recomendada pelo fabricante (. A pulverização será realizada com o auxílio de um pulverizador costal pressurizado com CO2, barra de 2 m e espaçamento entre bicos de 0,5 m (pontas tipo leque XR 110.02), sendo o volume de calda utilizado de 150 L/ha. Para evitar a movimentação e/ou fuga das lagartas, após a infestação das plantas será colocado tecido “voile” sobre cada planta, o qual será sustentado por uma estrutura de barras de alumínio. O delineamento experimental será em blocos inteiramente casualizados, com 50 plantas de milho Bt ou não-Bt, totalizando 150 lagartas de 1º ou 3º instar larval para cada linhagem de S. frugiperda estudada (Tabela 1). Após 48 horas da pulverização dos tratamentos, para cada planta será atribuída uma nota de dano em folhas e cartucho, de acordo com a escala Davis (0 - nenhum dano visual a 9 - danos severos) (DAVIS et al., 1992). Além da nota de dano também se contabilizará o número de lagartas vivas em cada planta. Os dados de nota de dano e lagartas sobreviventes serão submetidos à análise de normalidade pelo teste de Shapiro-Wilk usando o procedimento PROC UNIVARIATE no SAS® 9.1 (SAS INSTITUTE, 2011). Em seguida, todos os dados serão analisados utilizando procedimento PROC GLM no SAS® 9.1 (SAS INSTITUTE, 2011). A diferença entre os tratamentos será determinada com o uso do procedimento LSMEANS ao nível de significância P = 0,05 no SAS® 9.1 (SAS INSTITUTE, 2011).

Efeito residual de vírus sobre a mortalidade de S. frugiperda

Para avaliar o efeito residual do virus será utilizado a dose recomendada pelo fabricante do produto (Cartugen™ - 200 mL do produto comercial por 150 Litros de água). Para tanto, plantas de milho Herculex (H), YieldGard VT PRO™ (VT), PowerCore™ (PW) e não-Bt, nos estágios fenológicos V6, cultivadas em casa de vegetação, conforme descrito anteriormente, serão pulverizadas com auxilio de câmera de pulverização automática III Pulverizador, Hollandale, MN, EUA, equipado com pontas de bicos tipo ventilador XR 110.02 (Teejet Technologies, Glendale Heights, Illinois, IL, EUA) utilizando um volume de calda de 150L por hectare. Feito isso, aos 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12 Dias Após a Pulverização (DAP), folhas de milho do terço superior da planta serão retiradas e, em laboratório, cortadas em pedaços de 5 cm2 que serão acondicionados em placas de bioensaio com 16 células (5,5 centímetros de comprimento x 4,0 cm de profundidade × 3,0 centímetros de altura por poço) sobre uma mistura não-geleificada de ágar-água (2,5%). As folhas serão separadas da camada de ágar-água por um papel filtro. Posteriormente, com o auxílio de um pincel fino, será transferido uma neonata (< 24 h de idade) das linhagens de S. frugiperda (Tabela 1) de acordo com o alimento de criação na qual as lagartas estavam sendo mantidas. Como testemunha (controle negativo) para cada linhagem de inseto avaliada, serão utilizados plantas de milho Bt ou não-Bt, sem a aplicação de virus. Após a inoculação, as placas serão acondicionadas em câmara climatizada a 27 ± 1°C, umidade relativa 60 ± 10% e fotofase de 14h. O delineamento experimental será inteiramente casualizado com 10 repetições, sendo cada repetição constituída de 16 lagartas, totalizando 160 neonatas/linhagem por tempo após a pulverização. A mortalidade dos insetos será avaliada a cada 24 horas. Os dados de mortalidade serão submetidos à análise de resíduos para confirmar a suposição de normalidade com um teste de Shapiro-Wilk usando o procedimento PROC UNIVARIATE no software SAS® 9.1 (SAS INSTITUTE, 2011). Em seguida, os dados serão submetidos à análise de variância utilizando o procedimento PROC GLM no SAS® 9.1. As diferenças entre tratamentos serão determinadas pela análise de mínimos quadrados (opção PDIFF em PROC GLM) com ajuste de Tukey (P = 0,05) no software SAS® 9.1 (SAS INSTITUTE, 2011).

A proposta é continuidade de trabalhos que foram e estão sendo desenvolvidos nos últimos anos em parceria com diferentes instituições, tais como, a Universidade Federal de Pelotas, Universidade Federal de Santa Maria, Escola Superior da Agricultura “Luiz de Queiroz” e Embrapa Clima Temperado. Estas instituições, nos últimos anos, vêm trabalhando de forma conjunta com o proponente desse projeto visando o entendimento da resistência de S. frugiperda as tecnologias de milho Bt. A proposta conta com a participação de alunos da UFPel vinculados ao curso de graduação e do programa de Pós Graduação em Fitossanidade onde o proponente é membro permanente. O grupo de pesquisa acredita que a utilização conjunta de diferentes estratégias de controle, conforme preconizado pelo MIP, pode viabilizar a supressão populacional da praga no campo sem ocorrer perdas de produção. Ademais, as tecnologias estudadas (vírus entomopatogênicos e parasitoides de ovos) são aderentes aos sistemas sustentáveis de produção. Para o desenvolvimento do projeto, contamos com diferentes estruturas laboratoriais, como o laboratório de Biologia de Insetos e Laboratório de Manejo Integrado de Pragas da Faculdade de Agronomia Eliseu Maciel (UFPEL) e os Laboratórios de Entomologia da Universidade Federal de Santa Maria e da Embrapa Clima Temperado. Ademais, contamos com duas casas de vegetações climatizadas para o desenvolvimento dos trabalhos de semi-campo e uma estação experimental (Fazenda Palma) localizada no Centro Agropecuário da Palma as margens da BR 116, Pelotas, para a realização dos estudos de campo.