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A técnica reprodutiva bovina para superovulação é utilizada em todo o mundo e há diversos estudos sendo realizados que buscam a simplificação dos protocolos hormonais, por serem exaustivos e onerosos. Atualmente, ainda não se tem disponível no mercado, um fármaco que consiga reduzir o número de aplicações ou dose hormonal.
Com isso, uma nova tecnologia que permita reduzir o número de aplicações é de extrema importância, tanto para a indústria farmacêutica veterinária, quanto para o produtor/criador pela simplificação do manejo com os animais.
Através deste projeto, será possível aumentar o conhecimento das funções e características do FSH e ainda desenvolver uma nova base polimérica, termo reversível, biodegradável e atóxica que permitirá a liberação controlada deste hormônio. Além disso, simplificar o protocolo através da redução do número de aplicações, consequentemente, reduzir custos e simplificar manejos, além de proporcionar bem-estar animal, garantindo ao produtor e a indústria farmacêutica um fármaco inovador, com menor custo e maior eficiência para o mercado.

O projeto que compõe esta proposta envolve o desenvolvimento de uma formulação polimérica, biodegradável, para a administração sustentada do hormônio reprodutivo FSH. As formulações termo reversíveis são também conhecidas como “géis inteligentes”, pois são soluções poliméricas líquidas à temperatura ambiente que gelificam quando em contato com a temperatura corporal, formando o gel que servirá como sistema de liberação controlada do fármaco. O fato das formulações serem liquidas a temperatura ambiente, favorece o fracionamento de doses para adaptação a qualquer espécie e categoria animal. A seguir estão descritos os materiais que serão utilizados, bem como as metodologias que serão aplicadas no preparo e na avaliação (in vitro e in vivo) das formulações:

c.1) Reagentes e insumos farmacêuticos necessários
= Polímeros biodegradáveis;
= Hormônio reprodutivo: Hormônio Folículo Estimulante (FSH);
= Água para injeção, água MiliQ e solução fisiológica (NaCl 0,9%);
= Soluções Tampão Fosfato 0,1 M (K2HPO4 e KH2PO4).

c.2) Preparo das formulações
As soluções poliméricas serão preparadas de acordo com o clássico "método a frio" (Schmolka, 1972). Os polímeros (principais e acessórios) serão pesados e adicionados lentamente à em água fria, ficando em hidratação com água de alta pureza na temperatura de 4-8 °C, por 24 horas, até que uma solução límpida seja obtida. Em seguida, quantidades suficientes dos hormônios (de acordo com o intervalo de concentração estabelecido no protocolo terapêutico originário) serão dissolvidos em água injetável ou em Polietilenoglicol específico, para depois ser incorporada à solução polimérica.

c.3) Ensaios in vitro
Nessa etapa, as formulações desenvolvidas serão submetidas a ensaios laboratoriais, conforme preconizado pelas farmacopéias nacional e/ou internacionais. Serão preparados simuladores in vitro, para avaliação das formulações num ambiente semelhante ao que se propõe implantá-lo terapeuticamente e de acordo com a via de administração proposta. A partir disso serão feitos os ajustes necessários, tanto na carga da substância ativa como na concentração dos adjuvantes, processos que serão repetidos inúmeras vezes até encontrarmos as formulações ideais (Farmacopéia Brasileira, 1988; British Pharmacopeia, 2001; The United State Pharmacopeia, 2000).

c.3.1) Determinação da temperatura de transição (sol-gel):
A temperatura de transição de fase sol-gel será determinada pelo método de inversão tubo (Garripelli et al., 2010). Alíquotas de 2 ml são transferidas para tubos de 13 mm num banho com água a 4 °C com agitação. A temperatura do banho é aumentada de 2°C em 2°C até completa estabilização das formulações. Quando a solução polimérica parar de fluir sob a inclinação do tubo a 90°C, é registrada a temperatura de geleificação ou temperatura de transição sol-gel.

c.3.2) Ensaio de erosão/dissolução do gel:
O perfil de erosão/dissolução do gel é determinado por gravimetria, em que um frasco de vidro de 13 mm de diâmetro, pesado previamente, contendo um volume conhecido do gel, que é equilibrado a 37°C e coberto por uma solução de tampão fosfato pH 7,4 na condição de não saturação do meio (Sink condition), para servir como meio de liberação para os hormônios reprodutivos em questão. Em seguida são colocados num banho-maria a 37°C sob agitação constante e em intervalos pré-definidos, o meio de liberação de cada tubo é removido, o frasco pesado e a massa do gel erodido/dissolvido é calculada pela diferença de peso do frasco (Zhang et al., 2002).

c.3.3) Ensaio de liberação in vitro do hormônio reprodutivo:
Conforme a descrição do ensaio de erosão, o meio de liberação retirado dos tubos a cada intervalo de pesagem é submetido ao doseamento do hormônio em espectrofotômetro (FEMTO, 700 Plus), com comprimento de onda na região do visível, para a determinação do perfil de liberação in vitro, a partir das absorbâncias medidas e comparadas com a curva de calibração de cada hormônio reprodutivo. Todos os testes serão realizados em triplicata.

c.4) Estudo in vivo - Eficácia do sistema de liberação sustentada

Será realizado em vacas da fazenda Granja 4 Irmãos, localizada no 4º Distrito – Taim. Rio Grande. Nesta parte do estudo, será escolhida a melhor formulação, com base nos resultados da farmacocinética. Serão utilizadas aproximadamente 10 vacas, provenientes, clinicamente saudáveis, pesando entre 500 e 600 kg. Grupo 1 (n=5) – que recebera uma dose subcutânea da nova formulação na tábua do pescoço (100mg/20ml) e grupo 2 (n=5) – que recebera uma dose subcutânea Folltropin® - V (100mg/20ml), também na tábua do pescoço.
Amostras de sangue serão coletadas durante 6 dias, a cada 12h após tratamento. Serão coletadas por punção do complexo arterio-venoso coccígeno através de tubos (10mL, Vacutainer®) com EDTA para obtenção do plasma. Todas as amostras serão centrifugadas a 1500 xg durante 15 min. O plasma será transferido para tubos de eppendorf, identificados e armazenados a -20ºC até a realização das análises. Será determinado os teores séricos dos hormônios reprodutivos, como: FSH. A leitura desta será realizada no analisador automático de imunoensaios (ACCESS Beckman Coulter). Além disso, será avaliado, através de ultrassom, a evolução folicular dos animais.
Após análise destes resultados, será utilizado outras 10 vacas, clinicamente saudáveis, pesando entre 500 e 600 kg, para ajuste de protocolo. Elas serão divididas em dois grupos. Grupo 3 - (n=5) – que recebera uma dose subcutânea (100mg/20ml do FSH de liberação sustentada) da nova formulação na tábua do pescoço, durante 4 dias, totalizando 4 aplicações. O grupo 4 (n=5) – recebera o protocolo indicado na bula do fármaco já comercializado mundialmente (Folltropin® - V) ou seja, 2,5ml (50 mg NIH-FSH-P1) por injeção intramuscular 2 vezes ao dia, durante 4 dias, totalizando 8 aplicações.
Amostras de sangue serão coletadas durante 6 dias, a cada 12h após tratamento. Serão coletadas por punção do complexo arterio-venoso coccígeno através de tubos (10mL, Vacutainer®) com EDTA para obtenção do plasma. Todas as amostras serão centrifugadas a 1500 xg durante 15 min. O plasma será transferido para tubos de eppendorf, identificados e armazenados a -20ºC até a realização das análises. Será determinado os teores séricos dos hormônios reprodutivos, como: FSH. A leitura desta será realizada no analisador automático de imunoensaios (ACCESS Beckman Coulter). Além disso, será avaliado, através de ultrassom, a evolução folicular dos animais.

Análise Estatística
Os dados obtidos destes experimentos serão analisados no programa estatístico SAS (SAS Institute Inc., Cary, EUA). As médias serão analisadas pelo método MIXED MODELS, considerando o animal, o grupo e o momento da coleta. A comparação de médias individuais será feita através do teste de Tukey-Kramer. Médias pontuais serão analisadas pelo método One-way ANOVA. A correlação entre as variáveis será feita pelo coeficiente de correlação de Pearson. Serão considerados significativos valores de P<0,05.

Resultados pretendidos

A presente proposta envolve um projeto de inovação incremental que poderá colocar a instituição do proponente no cenário da inovação tecnológica nacional por ter a possibilidade de transferência de tecnologias para o setor industrial, além de trazer grandes benefícios para o produtor, como permitir a simplificação do manejo reprodutivo e reduzir custos, além de proporcionar bem-estar animal.
Espera-se que os resultados obtidos tenham impactos econômicos e sociais para o âmbito acadêmico, indústria farmacêutica veterinária e ainda, para os criadores/produtores, pela importância da nova tecnologia a ser desenvolvida, contribuindo para o desenvolvimento do setor como um todo.
Cabe ressaltar que serão envolvidos na execução deste projeto, estudantes de iniciação científica e tecnológica do curso de graduação em Zootecnia, Medicina Veterinária e Ciências Biológicas, além de mestrandos e doutorandos de diferentes áreas de conhecimento.

Indicadores de progresso ao final de cada ano do projeto:
Serão publicados resumos simples e expandidos em congressos da área descrevendo os resultados parciais obtidos nos experimentos.

Indicadores de resultados ao final do projeto:
• Produzir uma tese de doutorado.
• Publicar ao menos 2 artigos em revistas de circulação nacional ou internacional, com boa classificação no “Sistema de Classificação de Periódicos, Anais e Revistas” da CAPES.
• Divulgar os resultados em congressos da área em âmbito nacional.
• Divulgar os resultados em congressos da área em âmbito local e regional, tais como Congressos de Iniciação Científica e Encontros de Pós-graduação.