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O SARS-CoV-2 está classificado na família Coronaviridae e gênero Betacoronavirus (Shi et al., 2020). Desde a sua identificação, o vírus tem se disseminado globalmente, causando milhares de mortes e um enorme impacto na economia e nos sistemas de saúde mundial. A biologia dos coronavírus (CoVs), como demonstrado ainda durante a epidemia da Síndrome Respiratória Aguda Grave (SARS), da Síndrome Respiratória do Oriente Médio (MERS), e atualmente com a COVID-19, é caracterizada por eventos frequentes de mudança de hospedeiro, sejam eles animal-humano (zoonose), humano-animal (zoonose reversa) ou de animal para animal. Nos últimos anos, vários eventos de transmissão cruzada entre espécies, bem como alterações no tropismo de vírus, deram origem a novos CoV, causando doenças em animais e humanos, como coronavírus bovino (BCoV), coronavírus humano (HCoV-OC43, HCoV-229E, HCo-HKU1 e HCoV-NL63), coronavírus canino (CCoV) e coronavírus felino (FCoV) (Li et al., 2018).
Estudos epidemiológicos e moleculares sugerem que o SARS-CoV-2 tem como hospedeiro definitivo um morcego insetívoro (Rhinolophus affinis) que, após infectar um pangolim (Manis javanica), teria se adaptado à espécie humana (Lan et al 2020). O SARS-CoV-2 e o RaTG13 (coronavírus isolado do morcego Rhinolophus affinis) apresentam aproximadamente 96% de identidade de aminoácidos, diferindo apenas um pouco na região RBD (receptor-binding domain) da glicoproteína S (spike) (Andersen et al., 2020). O RBD corresponde ao local de ligação do vírus ao receptor das células do hospedeiro (Hoffmanm et al., 2020, Zhang et al., 2020, Walls et al., 2020). Demonstrou-se que seis aminoácidos do RBD são críticos para a ligação à receptores ACE2 (enzima conversora da angiotensina 2), e consequentemente, para determinar o espectro de hospedeiros. O SARS-CoV-2 parece ter um RBD que se liga com alta afinidade à ACE2 de humanos, pangolim, furões (Mustela furo), gatos domésticos (Felis domesticus), tigres, leões e outras espécies (Andersen et al., 2020).
O surto de SARS-CoV impulsionou a descoberta de novos CoVs em diversos animais. Recentemente, vários α-CoVs e β-CoVs foram identificados em roedores na China e na Europa (Wang et al, 2015, Tsoleridis et al., 2016, Ge et al, 2017), levantando a hipótese de que roedores possam carregar CoVs desconhecidos, com potencial zoonótico. Foi encontrada alta homologia entre sequências dos CoVs de ratos e morcegos, sugerindo que possam atuar como importantes reservatórios (Phan et al., 2018). Ainda durante o surto de SARS-CoV, foram encontrados gatos domésticos dos arredores de Hong Kong que soro-converteram contra o vírus. Gatos e furões foram suscetíveis à infecção experimental por um SARS-CoV (Martina et al., 2003). Shi et al. (2020) investigaram a suscetibilidade de furões, cães, gatos, suínos, galinhas e patos ao SARS-CoV-2. Após infecção experimental ocorreu replicação e o vírus foi transmitido eficientemente pela via respiratória, em gatos e furões. Nos cães, RNA viral foi detectado em swab retal, e embora nenhum RNA tenha sido detectado em órgãos e tecidos, em alguns cães foram detectados anticorpos para SARS-COV-2. Estas descobertas sugerem que os gatos e cães domésticos possuem baixa suscetibilidade ao SARS-CoV-2, mas que podem atuar como importantes reservatórios do vírus. Se tal fato for verdadeiro isso implica em medidas importantes de manejo para controle da COVID-19. Zhou et al. (2020) relataram que, com exceção de células de camundongos, células de humanos, morcegos, civetas e suínos são suscetíveis à infecção com o SARS-CoV-2. No Brasil, as informações a respeito da diversidade de CoV em morcegos, roedores, gatos e cães são escassas, e inexistentes com relação ao SARS-CoV-2.
A ligação do SARS-CoV-2 a ACE2 (enzima conversora de angiotensina 2) poderia explicar, em parte, a transmissão eficiente em humanos, como foi no caso do SARS-CoV. Os dois tipos de vírus utilizam a ACE2 como receptor de entrada e empregam a serina protease celular TMPRSS2 na ativação da glicoproteína S. Dentre as células que expressam ACE2, 83% são pneumócitos do tipo II, o que pode justificar a pneumonia causada pelo SARS-CoV. O ACE2 também atua como uma proteção contra lesões pulmonares. Assim, o SARS-CoV desregula uma via de proteção pulmonar (Hoffmann et al., 2020). Além dos seis domínios do RBD associados à ligação ao receptor ACE2 humano, SARS-CoV-2 possui ainda um sítio de clivagem polibásico (RRAR) na junção S1/S2 da glicoproteína S. Isso permite a clivagem efetiva pela furina e outras proteases celulares. Uma prolina líder também é inserida neste sítio (PRRAR), resultando na adição de glicanos, que flanqueiam o local de clivagem e são exclusivos do SARS-CoV-2. Especula-se que a clivagem por proteases do tipo furina poderia aumentar o tropismo de células e tecidos do SARS-CoV-2 em relação à SARS-CoV, além de aumentar a transmissibilidade e/ou alterar sua patogenicidade (Andersen et al., 2020).
Neste sentido, é necessário a identificação de homologias no domínio RBD dentre os CoV circulantes, além da análise de similaridade com epítopos específicos presentes na proteína S. Estudos avaliando a resposta contra o SARS-CoV relacionam a maior produção de anticorpos com a severidade da doença (Mei-Shang et al., 2005). A ADE (antibody-dependent enhancement) poderia ocorrer devido a exposição anterior a epítopos antigênicos similares, presumivelmente de vírus locais circulantes. Além disto, foi ainda demonstrado que vários epítopos identificados na proteína S do SARS-CoV-2 podem alinhar com um coronavírus respiratório canino (CR-CCoV) e possivelmente estar envolvidos em ADE (Tilocca et al., 2020).

Os animais sinantrópicos utilizados neste estudo serão capturados pelo NURFS e Centro de Triagem de Animais Silvestres (CETAS) da UFPEL. Para captura dos morcegos será solicitado ainda autorização no ICMBio - Sistema de Autorização e Informação em Biodiversidade. Não será realizado isolamento viral, não existindo a necessidade de Certificado de Qualidade de Biossegurança para a manipulação viral.
Cães e gatos atendidos em Clínicas e Hospitais Veterinários em Pelotas, Rio Grande, Passo Fundo (UPF), e Uruguaiana (UNIPAMPA), terão swabs (nasal e/ ou retal) coletados. Estima-se uma amostragem de 200 cães e gatos, dentre as várias regiões estabelecidas. As capturas dos exemplares de Tadarida brasiliensis serão realizadas em abrigos urbanos localizados em pontos distintos do município de Pelotas/RS através de redes de neblina ou armadilhas de harpa dispostas próximo às aberturas por onde os morcegos entram e saem. As armadilhas serão revisadas a cada 15 minutos para evitar que o animal seja ferido ou morto. Após as coletas, os indivíduos serão liberados no mesmo local de captura. O cálculo do número amostral foi determinado a partir de estimativa, uma vez que não se conhece o número total da população estudada. Espera-se 72 capturas no período. Amostras de fezes serão coletadas diretamente de morcegos individuais durante o evento da captura e/ou serão obtidos swabs retal. As amostras serão acondicionadas em RNAlater (QIAGEN) e mantidas a -80°C até o processamento.
As capturas dos exemplares de roedores serão feitas em ambiente urbano, em pontos distintos do município de Pelotas/RS, com o uso de ratoeira. Estima-se um total de 180 capturas no período. Para a coleta das amostras dos roedores, será feita a eutanásia com aprofundamento anestésico com o uso de isoflurano. Será realizada pesquisa viral em amostras de pulmões e intestino.
RNA total será extraído utilizando QIAamp Viral RNA Mini Kit (QIAGEN), de acordo com as recomendações do fabricante. Um RT-PCR em tempo real one-step será realizado com base na detecção SYBR Green, utilizando primers degenerados que permitem a detecção de um amplo espectro de CoV (Escutenaire et al., 2007). Como controles positivos serão utilizados isolados/cepas de coronavírus canino do estoque viral do Laboratório de Virologia e Imunologia da UFPel. O RT-PCR em tempo real para o SARS-CoV-2 será realizado para as amostras que forem positivas no RT-PCR para a detecção de coronavírus genérico, conforme protocolo padrão de diagnóstico, de acordo com Charité et al. (2020).
RT-PCR para glicoproteína S: Serão construídos primers que amplifiquem todo o domínio da glicoproteína S, tendo como base as espécies de coronavírus amplificadas anteriormente. Os primers serão construídos no OligoPerfect (Thermo Fischer) a partir de sequências depositadas no Genbank
Sequenciamento e análise filogenética: Após purificação dos produtos de PCR as amostras serão sequenciadas em quadruplicata utilizando o kit BigDye terminator (Thermo Fischer). Os resultados serão analisados pelo programa Staden para obtenção da sequência consenso.
A estrutura da proteína S será pesquisada contra sequências no Protein Data Bank (PDB) . Os locais de clivagem na proteína S serão previstos através da comparação de sequências de aminoácidos. As árvores filogenéticas serão construídas usando o algoritmo de máxima verossimilhança (ML), com valores de bootstrap de 1000 repetições nos softwares MEGA 6 e PhyML.

- Primeiro semestre: serão iniciadas as coletas de swabs com meta de obtenção de 30 amostras/cães-gatos/mês, preferencialmente de tutores que testaram positivos para o SARS-CoV-2. Serão realizadas capturas e coleta de amostras de morcegos e roedores. Serão realizadas extrações de RNA e síntese de cDNA. Serão adquiridos os controles para as reações de PCR, os quais serão padronizados ainda no primeiro trimestre.
- Segundo semestre: serão ainda realizadas coletas e processamento de amostras. Com todos os protocolos de RT-PCR padronizados, serão realizadas as reações para as todas as amostras obtidas.
- Terceiro semestre: as amostras positivas serão purificadas, submetidas ao sequenciamento genético e analisadas em softwares específicos.
- Quarto semestre: serão realizadas as análises moleculares com base na sequência de nucleotídeos e aminoácidos, além da análise filogenética das sequencias obtidas. Artigos científicos serão enviados para publicação e será confeccionado o relatório final.