Nome do Projeto
Identificação e caracterização molecular de coronavírus (CoV) em animais de companhia e em morcegos e roedores que coabitam espaços com humanos
Ênfase
Pesquisa
Data inicial - Data final
01/07/2020 - 01/08/2023
Unidade de Origem
Coordenador Atual
Área CNPq
Ciências Agrárias
Resumo
O presente projeto será desenvolvido pelo Grupo de Pesquisa em Virologia e Imunologia Veterinária da UFPEL, em parceria com pesquisadores da mesma Instituição e outras Instituições de Ensino e Pesquisa (FEEVALE, UNIPAMPA e UFC). O estudo visa a identificação de SARS-CoVID-2 e de outros coronavírus (CoV) em animais de companhia (cães e gatos) e em animais silvestres sinantrópicos que coabitam o espaço humano (morcegos e roedores comensais) na região de Pelotas, Rio Grande e Uruguaiana, e verificar características no genoma dos CoV obtidos que possam indicar potencial para infecção de humanos. A análise molecular será realizada com ênfase em recombinações, homologias com resíduos de aminoácidos da região RDB da glicoproteína S que correspondem à ligação do vírus ao receptor ACE2 de humanos, e na existência de homologias com epítopos descritos na proteína S. Existem vários questionamentos que necessitam investigação e que podem ser respondidos, mesmo que parcialmente, com o presente projeto. A primeira questão é referente à infecção e circulação de SARS-CoV-2 entre as espécies animais do estudo, particularmente cães e gatos. A segunda é sobre a existência de outros CoV com similaridades ao SARS-CoV-2 e com potencial de introdução e circulação entre a população humana, causando desde infecções assintomáticas, resfriados comuns, até síndromes graves. A terceira questão é a determinação em específico sobre a existência de homologias no domínio RBD (domínio de ligação ao receptor) da proteína S, principal responsável por adsorção ao receptor ACE2 e, portanto, inferir em risco de infecção de pessoas. Por último, o estudo poderá identificar homologia e/ou diferenças importantes entre epitopos da proteína S dos coronavírus circulantes nas diferentes espécies da região estudada, sugerindo implicações importantes tanto no processo de infecção como em nível de resposta imunológica

Objetivo Geral

Identificação de coronavírus em animais de companhia (cães e gatos) e em animais silvestres sinantrópicos que coabitam o espaço humano (morcegos Tadarida brasiliensis e roedores urbanos Mus musculus, Rattus norvegicus e Rattus rattus). O estudo propões ainda a caracterização genética dos coronavírus obtidos com ênfase em recombinações e homologias com resíduos de aminoácidos da região RDB da glicoproteína S de CoV humanos, e análise de similaridade de epítopos descritos na proteína S.

Justificativa

O SARS-CoV-2 está classificado na família Coronaviridae e gênero Betacoronavirus (Shi et al., 2020). Desde a sua identificação, o vírus tem se disseminado globalmente, causando milhares de mortes e um enorme impacto na economia e nos sistemas de saúde mundial. A biologia dos coronavírus (CoVs), como demonstrado ainda durante a epidemia da Síndrome Respiratória Aguda Grave (SARS), da Síndrome Respiratória do Oriente Médio (MERS), e atualmente com a COVID-19, é caracterizada por eventos frequentes de mudança de hospedeiro, sejam eles animal-humano (zoonose), humano-animal (zoonose reversa) ou de animal para animal. Nos últimos anos, vários eventos de transmissão cruzada entre espécies, bem como alterações no tropismo de vírus, deram origem a novos CoV, causando doenças em animais e humanos, como coronavírus bovino (BCoV), coronavírus humano (HCoV-OC43, HCoV-229E, HCo-HKU1 e HCoV-NL63), coronavírus canino (CCoV) e coronavírus felino (FCoV) (Li et al., 2018).
Estudos epidemiológicos e moleculares sugerem que o SARS-CoV-2 tem como hospedeiro definitivo um morcego insetívoro (Rhinolophus affinis) que, após infectar um pangolim (Manis javanica), teria se adaptado à espécie humana (Lan et al 2020). O SARS-CoV-2 e o RaTG13 (coronavírus isolado do morcego Rhinolophus affinis) apresentam aproximadamente 96% de identidade de aminoácidos, diferindo apenas um pouco na região RBD (receptor-binding domain) da glicoproteína S (spike) (Andersen et al., 2020). O RBD corresponde ao local de ligação do vírus ao receptor das células do hospedeiro (Hoffmanm et al., 2020, Zhang et al., 2020, Walls et al., 2020). Demonstrou-se que seis aminoácidos do RBD são críticos para a ligação à receptores ACE2 (enzima conversora da angiotensina 2), e consequentemente, para determinar o espectro de hospedeiros. O SARS-CoV-2 parece ter um RBD que se liga com alta afinidade à ACE2 de humanos, pangolim, furões (Mustela furo), gatos domésticos (Felis domesticus), tigres, leões e outras espécies (Andersen et al., 2020).
O surto de SARS-CoV impulsionou a descoberta de novos CoVs em diversos animais. Recentemente, vários α-CoVs e β-CoVs foram identificados em roedores na China e na Europa (Wang et al, 2015, Tsoleridis et al., 2016, Ge et al, 2017), levantando a hipótese de que roedores possam carregar CoVs desconhecidos, com potencial zoonótico. Foi encontrada alta homologia entre sequências dos CoVs de ratos e morcegos, sugerindo que possam atuar como importantes reservatórios (Phan et al., 2018). Ainda durante o surto de SARS-CoV, foram encontrados gatos domésticos dos arredores de Hong Kong que soro-converteram contra o vírus. Gatos e furões foram suscetíveis à infecção experimental por um SARS-CoV (Martina et al., 2003). Shi et al. (2020) investigaram a suscetibilidade de furões, cães, gatos, suínos, galinhas e patos ao SARS-CoV-2. Após infecção experimental ocorreu replicação e o vírus foi transmitido eficientemente pela via respiratória, em gatos e furões. Nos cães, RNA viral foi detectado em swab retal, e embora nenhum RNA tenha sido detectado em órgãos e tecidos, em alguns cães foram detectados anticorpos para SARS-COV-2. Estas descobertas sugerem que os gatos e cães domésticos possuem baixa suscetibilidade ao SARS-CoV-2, mas que podem atuar como importantes reservatórios do vírus. Se tal fato for verdadeiro isso implica em medidas importantes de manejo para controle da COVID-19. Zhou et al. (2020) relataram que, com exceção de células de camundongos, células de humanos, morcegos, civetas e suínos são suscetíveis à infecção com o SARS-CoV-2. No Brasil, as informações a respeito da diversidade de CoV em morcegos, roedores, gatos e cães são escassas, e inexistentes com relação ao SARS-CoV-2.
A ligação do SARS-CoV-2 a ACE2 (enzima conversora de angiotensina 2) poderia explicar, em parte, a transmissão eficiente em humanos, como foi no caso do SARS-CoV. Os dois tipos de vírus utilizam a ACE2 como receptor de entrada e empregam a serina protease celular TMPRSS2 na ativação da glicoproteína S. Dentre as células que expressam ACE2, 83% são pneumócitos do tipo II, o que pode justificar a pneumonia causada pelo SARS-CoV. O ACE2 também atua como uma proteção contra lesões pulmonares. Assim, o SARS-CoV desregula uma via de proteção pulmonar (Hoffmann et al., 2020). Além dos seis domínios do RBD associados à ligação ao receptor ACE2 humano, SARS-CoV-2 possui ainda um sítio de clivagem polibásico (RRAR) na junção S1/S2 da glicoproteína S. Isso permite a clivagem efetiva pela furina e outras proteases celulares. Uma prolina líder também é inserida neste sítio (PRRAR), resultando na adição de glicanos, que flanqueiam o local de clivagem e são exclusivos do SARS-CoV-2. Especula-se que a clivagem por proteases do tipo furina poderia aumentar o tropismo de células e tecidos do SARS-CoV-2 em relação à SARS-CoV, além de aumentar a transmissibilidade e/ou alterar sua patogenicidade (Andersen et al., 2020).
Neste sentido, é necessário a identificação de homologias no domínio RBD dentre os CoV circulantes, além da análise de similaridade com epítopos específicos presentes na proteína S. Estudos avaliando a resposta contra o SARS-CoV relacionam a maior produção de anticorpos com a severidade da doença (Mei-Shang et al., 2005). A ADE (antibody-dependent enhancement) poderia ocorrer devido a exposição anterior a epítopos antigênicos similares, presumivelmente de vírus locais circulantes. Além disto, foi ainda demonstrado que vários epítopos identificados na proteína S do SARS-CoV-2 podem alinhar com um coronavírus respiratório canino (CR-CCoV) e possivelmente estar envolvidos em ADE (Tilocca et al., 2020).

Metodologia

Os animais sinantrópicos utilizados neste estudo serão capturados pelo NURFS e Centro de Triagem de Animais Silvestres (CETAS) da UFPEL. Para captura dos morcegos será solicitado ainda autorização no ICMBio - Sistema de Autorização e Informação em Biodiversidade. Não será realizado isolamento viral, não existindo a necessidade de Certificado de Qualidade de Biossegurança para a manipulação viral.
Cães e gatos atendidos em Clínicas e Hospitais Veterinários em Pelotas, Rio Grande, Passo Fundo (UPF), e Uruguaiana (UNIPAMPA), terão swabs (nasal e/ ou retal) coletados. Estima-se uma amostragem de 200 cães e gatos, dentre as várias regiões estabelecidas. As capturas dos exemplares de Tadarida brasiliensis serão realizadas em abrigos urbanos localizados em pontos distintos do município de Pelotas/RS através de redes de neblina ou armadilhas de harpa dispostas próximo às aberturas por onde os morcegos entram e saem. As armadilhas serão revisadas a cada 15 minutos para evitar que o animal seja ferido ou morto. Após as coletas, os indivíduos serão liberados no mesmo local de captura. O cálculo do número amostral foi determinado a partir de estimativa, uma vez que não se conhece o número total da população estudada. Espera-se 72 capturas no período. Amostras de fezes serão coletadas diretamente de morcegos individuais durante o evento da captura e/ou serão obtidos swabs retal. As amostras serão acondicionadas em RNAlater (QIAGEN) e mantidas a -80°C até o processamento.
As capturas dos exemplares de roedores serão feitas em ambiente urbano, em pontos distintos do município de Pelotas/RS, com o uso de ratoeira. Estima-se um total de 180 capturas no período. Para a coleta das amostras dos roedores, será feita a eutanásia com aprofundamento anestésico com o uso de isoflurano. Será realizada pesquisa viral em amostras de pulmões e intestino.
RNA total será extraído utilizando QIAamp Viral RNA Mini Kit (QIAGEN), de acordo com as recomendações do fabricante. Um RT-PCR em tempo real one-step será realizado com base na detecção SYBR Green, utilizando primers degenerados que permitem a detecção de um amplo espectro de CoV (Escutenaire et al., 2007). Como controles positivos serão utilizados isolados/cepas de coronavírus canino do estoque viral do Laboratório de Virologia e Imunologia da UFPel. O RT-PCR em tempo real para o SARS-CoV-2 será realizado para as amostras que forem positivas no RT-PCR para a detecção de coronavírus genérico, conforme protocolo padrão de diagnóstico, de acordo com Charité et al. (2020).
RT-PCR para glicoproteína S: Serão construídos primers que amplifiquem todo o domínio da glicoproteína S, tendo como base as espécies de coronavírus amplificadas anteriormente. Os primers serão construídos no OligoPerfect (Thermo Fischer) a partir de sequências depositadas no Genbank
Sequenciamento e análise filogenética: Após purificação dos produtos de PCR as amostras serão sequenciadas em quadruplicata utilizando o kit BigDye terminator (Thermo Fischer). Os resultados serão analisados pelo programa Staden para obtenção da sequência consenso.
A estrutura da proteína S será pesquisada contra sequências no Protein Data Bank (PDB) . Os locais de clivagem na proteína S serão previstos através da comparação de sequências de aminoácidos. As árvores filogenéticas serão construídas usando o algoritmo de máxima verossimilhança (ML), com valores de bootstrap de 1000 repetições nos softwares MEGA 6 e PhyML.

Indicadores, Metas e Resultados

- Primeiro semestre: serão iniciadas as coletas de swabs com meta de obtenção de 30 amostras/cães-gatos/mês, preferencialmente de tutores que testaram positivos para o SARS-CoV-2. Serão realizadas capturas e coleta de amostras de morcegos e roedores. Serão realizadas extrações de RNA e síntese de cDNA. Serão adquiridos os controles para as reações de PCR, os quais serão padronizados ainda no primeiro trimestre.
- Segundo semestre: serão ainda realizadas coletas e processamento de amostras. Com todos os protocolos de RT-PCR padronizados, serão realizadas as reações para as todas as amostras obtidas.
- Terceiro semestre: as amostras positivas serão purificadas, submetidas ao sequenciamento genético e analisadas em softwares específicos.
- Quarto semestre: serão realizadas as análises moleculares com base na sequência de nucleotídeos e aminoácidos, além da análise filogenética das sequencias obtidas. Artigos científicos serão enviados para publicação e será confeccionado o relatório final.

Equipe do Projeto

NomeCH SemanalData inicialData final
ANA CAROLINA DE ASSIS SCARIOT
GEFERSON FISCHER1
ISABEL DE ALMEIDA MANCINI
MARCELO DE LIMA1
MARLETE BRUM CLEFF1
PAULO MOTA BANDARRA1
RAQUELI TERESINHA FRANCA2
SILVIA DE OLIVEIRA HUBNER4
WINNIE DE OLIVEIRA DOS SANTOS

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