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Segundo dados da Organização Mundial da Saúde (OMS), ao menos 350 milhões de pessoas vivem com depressão, considerada a principal causa de incapacidade na população em geral, e em torno de 1 milhão de pessoas a cada ano cometem suicídio, significando quase 3000 vidas perdidas a cada dia. Para cada pessoa que comete suicídio, 20 ou mais atentam contra sua própria vida (WHO, 2012). Além disso, esta doença causa enormes prejuízos econômicos, os quais foram estimados em mais de R$ 2 trilhões no mundo todo em 2010 e esse custo deve mais do que dobrar nos próximos 20 anos (Annan, 2014). Esses dados demonstram a importância da disponibilidade de tratamentos eficazes para a depressão.
Existem várias teorias relacionadas à patogênese da depressão, dentre elas a redução de monoaminas, como serotonina, noradrenalina e dopamina, no sistema nervoso central (Coppen, 1967), disfunção do sistema glutamatérgico (Sanacora et al., 2008), alterações no eixo hipotálamo-pituitária-adrenal (Merali et al., 2004), redução de fatores neurotróficos (Duman and Monteggia, 2006) e disfunções do sistema imune (Dantzer et., 2014). Dentre essas teorias, a mais amplamente aceita é a teoria do déficit monoaminérgico. Inúmeras evidências contribuem para a teoria monoaminérgica, sendo que dentre as diferentes monoaminas, a 5-HT é a mais extensivamente estudada. A 5-HT é sintetizada no neurônio pré-sináptico a partir do triptofano pela ação da enzima triptofano hidroxilase e armazenada em vesículas. Após sua liberação na fenda sináptica e interação com os receptores serotoninérgicos, a 5-HT é recaptada para o interior do neurônio pré-sináptico por um transportador específico, onde é armazenada nas vesículas pré-sinápticas ou degradada pela enzima monoamino oxidase (MAO). Neste sentido, moléculas que bloqueiam a recaptação de serotonina ou inibem a enzima monoamino oxidase (MAO), responsável por degradar as monoaminas, aumentam a disponibilidade deste neurotransmissor na fenda sináptica e têm apresentado efetividade clínica como antidepressivos (Belmaker and Agam, 2008).
Considerando que a deficiência monoaminérgica é ainda considerada a teoria neurobiológica da depressão clinicamente mais relevante, os inibidores seletivos da recaptação de serotonina (ISRS) e noradrenalina (ISRN) são os principais antidepressivos prescritos. No entanto, muitos pacientes são resistentes a este tipo de tratamento, efeitos clínicos são perceptíveis apenas algumas semanas após o início da terapia (Dupuy et al., 2011; Hegadoren et al., 2009) e estudos avaliando a eficácia de ISRS têm demonstrado que grande parte da resposta antidepressiva é também vista nos grupos placebo (Kirsch et al., 2008; Lacasse and Leo, 2005). Além disso, em relação às drogas que possuem alguma efetividade clínica na depressão, todas elas apresentam inúmeras limitações, como lento início de ação e muitos efeitos colaterais (Páez-Pereda, 2005). Dessa forma, a busca por novas drogas que possam ser efetivas para o tratamento da depressão é de grande importância.
A dor, além de ser um mecanismo protetor que ocorre sempre que qualquer tecido é lesionado, é um efeito secundário, incapacitante, de muitas condições médicas, e o controle da dor é umas das prioridades terapêuticas mais importantes, uma vez que diminui drasticamente a qualidade de vida de seus portadores (Griffis, Compton e Doering, 2006). Enquanto a dor nociceptiva (dor fisiológica) é tipicamente transitória e requer um estímulo intenso para ser desencadeada, a dor patológica (dor clínica) é frequentemente persistente e está em geral, associada à inflamação (Medell e Sahenk, 2003). A dor engloba tanto componentes sensoriais como também cognitivos e afetivos. Os componentes afetivos da dor incluem sensações de aborrecimento, tristeza, ansiedade e depressão em resposta ao estímulo nocivo. Muitos esforços têm sido dedicados, buscando compreender os mecanismos celulares e moleculares envolvidos na origem da dor, com o objetivo de encontrar drogas eficazes, com baixos efeitos colaterais e que possam ser empregadas nestas circunstâncias (Kleczkowska e Lipkowski, 2013; Nadal et al, 2013). Atualmente não existe tratamento satisfatório e nem medidas adequadas e específicas para o controle da dor, o que motiva novos estudos para a descoberta de tratamentos mais efetivos.
A depressão e a dor compartilham um alto grau de comorbidade e muitos estudos têm demonstrado a estreita relação entre essas duas condições. Segundo dados clínicos, a prevalência de dor crônica em pacientes tratados para depressão atinge valores de 50–60% (von Knorring et al., 1983; Lee et al., 2009; Aguera-Ortiz et al., 2011) e estudos longitudinais apontam que a depressão é um fator de risco para o desenvolvimento de dor crônica (Gureje et al., 2001; Carroll et al., 2004). Reciprocamente, a prevalência de depressão em pacientes com dor crônica pode chegar a 85 % (Bair et al., 2003; Williams et al., 2003). De fato, a dor é um importante fator de risco para a depressão. Em um estudo coorte, a severidade e cronicidade da dor foram significantemente associadas com o desenvolvimento de depressão (Hilderink et al., 2012).
A dor também afeta o prognóstico e o tratamento da depressão e vice-versa. Existe uma forte correlação entre a severidade da dor e o grau de depressão (Fishbain et al., 1997) e a severidade da dor basal antes do início da administração de antidepressivos tem sido mostrada como um forte fator preditivo negativo da resposta ao tratamento (Bair et al., 2004). Ao mesmo tempo, a depressão pode afetar negativamente o prognóstico e o tratamento da dor crônica. Pacientes com dor crônica e depressão relatam maior duração e severidade dos sintomas de dor (Bair et al., 2004) e apresentam menor resposta ao tratamento em comparação a pacientes não depressivos (Dworkin e Gitlin, 1991). A depressão influencia significativamente a percepção da intensidade da dor, e pacientes depressivos frequentemente apresentam alodínia (Blackburn-Munro e Blackburn-Munro, 2001; Wilson et al., 2001). Na prática clínica, a comorbidade entre dor e depressão tem sido rotulada como díade dor-depressão (Bair et al., 2004; Goldenberg, 2010). Isto implica que essas duas condições frequentemente coexistem e respondem a tratamentos de maneira similar, exacerbam uma a outra e compartilham as mesmas vias neurobiológicas. Além disso, ambas as patologias carecem de tratamentos mais eficazes (Millan, 2014).
Neste sentido, compostos orgânicos de selênio sintéticos têm recebido bastante atenção devido a diversas propriedades farmacológicas que os mesmos têm apresentado (Nogueira et al., 2004; Nogueira e Rocha, 2011). O selênio é um elemento traço amplamente distribuído pelo corpo humano, fazendo parte da composição química de selenoproteínas como a glutationa peroxidase, tioredoxina redutase e selenoproteína P, as quais são conhecidas pelo seu importante papel na proteção do organismo contra a peroxidação lipídica e danos celulares oxidativos (Steinbrenner e Sies, 2013). Interessantemente, alguns desses novos compostos orgânicos de selênio têm demonstrado tanto efeito antinociceptivo como antidepressivo (Savegnago et al., 2007; 2008; Brüning et al., 2010; 2011; 2015). Além disso, muitos compostos orgânicos de selênio apresentam efeito antioxidante (Nogueira and Rocha, 2011). Sabe-se que o estresse oxidativo também tem sido implicado na patogênese de diversas doenças psiquiátricas, incluindo depressão, e também no aumento da sensibilidade à dor, uma vez que o cérebro tem maior vulnerabilidade ao dano oxidativo (Sies, 1997). Baseado nisso, recentemente foi sintetizado uma série de benzamidas propargílicas contendo selênio com a finalidade de testá-las pré-clinicamente em modelos de dor e depressão em roedores e também avaliar seu efeito antioxidante. Cabe salientar que as benzamidas substituídas apresentam efeito analgésico e antipsicótico.
A dor é um fenômeno perceptual. Ela é gerada pelos nociceptores teciduais, modificada por mecanismos espinhais e supraespinhais e integrada em uma experiência sensorial com um componente afetivo no encéfalo. Dessa forma, o estudo da dor em modelos animais in vivo permite que a natureza multidimensional da dor seja examinada, possibilitando o desenvolvimento de novos alvos terapêuticos e triagem de novas moléculas com efeito antinociceptivo (Gregory et al., 2013). Alguns pesquisadores defendem a teoria de que somente humanos podem sentir dor e que animais apresentariam apenas nocicepção, sem o componente afetivo, enquanto outros argumentam que todos os vertebrados e até mesmo invertebrados podem ter a sensação de dor (Bateson, 1991; Carruthers, 1996; Sherwin, 2001). No entanto, de fato a dor em animais não pode ser monitorada diretamente, podendo apenas ser estimada avaliando uma resposta a um estímulo nocivo. Esses estímulos podem ser elétricos, térmicos, mecânicos ou químicos, sendo que este último tipo é o que provavelmente mais se aproxima da dor aguda clínica (Le Bars et al., 2001). Os principais testes nociceptivos são realizados em roedores e destacam-se o teste da retirada da cauda após um estímulo térmico (Janssen et al., 1963), o teste de contorção abdominal induzida por ácido acético (Correa et al., 1996), o teste de injeção de glutamato (Beirith et al., 2002) ou formalina (Hunskaar e Hole, 1987) na pata e o teste da chapa quente (Woolfe, 1944).
Da mesma forma, a utilização de modelos animais para o estudo da etiologia da depressão, bem como o desenvolvimento de novos alvos terapêuticos têm sido de extrema importância. Embora seja bastante difícil avaliar a depressão em animais, uma vez que sentimentos de tristeza, culpa e pensamentos suicidas são principalmente limitados aos humanos (DellaGioia e Hannestad, 2010), existem diversos fenótipos da depressão que podem ser reproduzidos e avaliados independentemente (Hasler et al., 2004). Um modelo animal de depressão deve ser análogo à sintomatologia clínica (validade facial), induzir mudanças comportamentais que podem ser

Drogas
As benzamidas selenopropargílicas (Figura 1) serão sintetizadas no Núcleo de Síntese e Aplicação de Compostos Orgânicos e Inorgânicos (NUSACOI), da Universidade Federal da Fronteira Sul (UFFS) – Campus Cerro Largo. As drogas e reagentes serão adquiridos da Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA) e do comércio local. Para os testes in vitro as benzamidas selenopropargílicas serão diluídas em DMSO e para a administração em camundongos as mesmas serão diluídas em óleo de canola.

Animais
Serão utilizados camundongos adultos (25-30 g) provenientes do Biotério da Universidade Federal de Pelotas. Todos os experimentos que se encontram aqui descritos serão conduzidos de acordo com as normas do Comitê de Ética e Bem-Estar Animal da UFPel (CEEA 4903-2017). Os grupos de animais serão acondicionados em caixas separadas, sob de temperatura de 22 ± 2ºC e mantidos em um ciclo de 12h claro/12h escuro. A dieta será constituída de ração comercial (GUABI, RS, Brasil) e água fresca ad libitum.

Protocolos experimentais
Testes in vitro
As benzamidas selenopropargílicas (figura 1) serão avaliadas inicialmente como scavengers dos radicais 2,2’-difenil-1-picrilhidrazil (DPPH) e ácido 2,2’-azino-bis (3-etilbenzotiazolina-6-sulfônico) (ABTS), frente à peroxidação lipídica e na atividade da MAO in vitro.

Figura 1: Estrutura química das benzamidas selenopropargílicas


Atividade scavenger dos radicais 2,2’-difenil-1-picrilhidrazil (DPPH) e ácido 2,2’-azino-bis (3-etilbenzotiazolina-6-sulfônico) (ABTS)
A atividade scavenger das benzamidas selenopropargílicas frente ao radical 2,2’-difenil-1-picrilhidrazil (DPPH) será realizada de acordo com Choi e cols. (2002), e frente ao radical ácido 2,2’-azino-bis (3-etilbenzotxiazolina-6-sulfônico) (ABTS) será realizada de acordo com Re e cols (1999). Neste teste não é necessário animais.

Efeito das benzamidas selenopropargílicas na peroxidação lipídica in vitro
O efeito protetor das benzamidas selenopropargílicas frente à peroxidação lipídica induzida por nitroprussiato de sódio será avaliado através da medida dos níveis de espécies reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) em homogeneizado de cérebro total de camundongos conforme descrito por Ohkawa e colaboradores (Ohkawa et al., 1979). (20 animais – quantidade de tecido cerebral necessária para este teste)

Efeito das benzamidas selenopropargílicas na atividade da monoamino-oxidase (MAO) in vitro
O efeito das benzamidas selenopropargílicas na atividade da MAO in vitro será avaliado conforme Krajl (1965), em preparado de mitocôndrias de cérebro de camundongo, conforme Soto-Otero e cols. (2001). (20 animais – quantidade de tecido cerebral necessária para este teste).

Testes comportamentais
Baseado nos testes de scavenger de radicais livres, níveis de espécies reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) e atividade da MAO, uma benzamida selenopropargílica será selecionada para os testes in vivo em camundongos. Serão realizados os testes da imersão da cauda, injeção de glutamato e chapa quente para avaliar o efeito antinociceptivo da benzamida selenopropargílica selecionada e os testes do nado forçado (TNF) e suspensão da cauda (TSC) para avaliar o efeito do tipo antidepressivo da mesma.

Teste da imersão da cauda
Neste teste serão realizadas uma curva dose-resposta e uma curva tempo-resposta para avaliação da atividade antinociceptiva da benzamida selenopropopargílica selecionada. Para a curva tempo-resposta, os animais serão tratados pela via intragástrica com 10 mg/kg da benzamida ou veículo (óleo de canola) e após diferentes tempos (15 min, 30 min, 1h e 2 h) o teste da imersão da cauda será realizado, conforme Janssen et al., (1963). Ressalta-se que esses tempos giram em torno de faixas amplamante utilizados para os estudos com compostos orgânicos de selênio em screenings de atividade farmacológica (Velasquez, 2017; Oliveira et al., 2012; Gai et al., 2010; Savegnago et al., 2007). Para a curva dose-resposta, os animais serão tratados pela via intragástrica com diferentes doses da benzamida selecionada (1, 10 e 50 mg/kg) ou veículo e após o melhor tempo obtido na curva tempo-resposta o teste da imersão da cauda será realizado. Salienta-se que iniciaremos pela maior dose, se esta apresentar efeito farmacológico, seguiremos com o delineamento dos grupos experimentais até a atingir a dose que não apresenta efeito farmacológico. Essas doses são escolhidas baseadas em resultados obtidos para atividades farmacológicas com diferentes compostos orgânicos contendo selênio (Velasquez, 2017; Oliveira et al., 2012; Gai et al., 2010; Bruning et al., 2011; Savegnago et al. 2008; Savegnago et al., 2007). A fluoxetina será utilizada como controle positivo, na dose de 10 mg/kg (Rodrigues-Filho, 1999).

Teste da injeção de glutamato
Os animais serão tratados pela via intragástrica com diferentes doses da benzamida selenopropargílica (1, 10 e 50 mg/kg) ou veículo e após o tempo de maior efeito antinociceptivo da benzamida selecionada no teste da imersão da cauda, o teste da injeção de glutamato será realizado, conforme Beirith et al., 2002. A fluoxetina será utilizada como controle positivo, na dose de 10 mg/kg.

Teste da chapa quente
Os animais serão tratados pela via intragástrica com diferentes doses da benzamida selenopropargílica (1, 10 e 50 mg/kg ) ou veículo e após o tempo de maior efeito antinociceptivo do composto no teste da imersão da cauda, o teste da chapa quente será realizado, conforme Ferreira et al., 2002. A fluoxetina será utilizada como controle positivo, na dose de 10 mg/kg.

Teste do nado forçado (TNF)
Neste teste serão realizadas uma curva dose-resposta e uma curva tempo-resposta para avaliação da atividade do tipo antidepressiva das benzamidas selenopropargílicas. Para a curva tempo-resposta, os animais serão tratados pela via intragástrica com 10 mg/kg da benzamida e após diferentes tempos (15 min, 30 min, 1h e 2 h) o teste do TNF será realizado, conforme conforme Porsolt et al. (1977). Para a curva dose-resposta, os animais serão tratados pela via intragástrica com diferentes doses da benzamida selecionada (1, 10 e 50 mg/kg) e após o melhor tempo obtido na curva tempo-resposta o teste do TNF será realizado. A fluoxetina será utilizada como controle positivo, na dose de 10 mg/kg.

Teste da suspensão da cauda (TSC)
Os animais serão tratados pela via intragástrica com diferentes doses da benzamida selenopropargílica (1, 10 e 50 mg/kg ) ou veículo e após o tempo de maior efeito do tipo antidepressivo do composto no TNF, o TSC será realizado, conforme Steru et al. 1985. A fluoxetina será utilizada como controle positivo, na dose de 10 mg/kg.

Teste do campo aberto
A fim de descartar qualquer efeito de um possível déficit locomotor causado pelos tratamentos nos testes de nocicepção e comportamento depressivo, imediatamente antes de cada teste comportamental os camundongos serão avaliados no teste do campo aberto, conforme Walsh e Cummins, 1976.

O papel do sistema serotoninérgico no efeito antinociceptivo da benzamida propargílica
Para avaliar a contribuição do sistema serotoninérgico no efeito antinociceptivo da benzamida selenopropargílica selecionada, diferentes grupos de animais serão pré-tratados com os antagonistas serotoninérgicos WAY100635 (antagonista do receptor 5-HT1A, 0,1 mg/kg, s.c.), ritanserina (antagonista do receptores 5-HT2A/2C, 4 mg/kg, i.p.) e ondansetrona (antagonista 5-HT3, 1 mg/kg, i.p.). 15 min após a administração dos antagonistas a benzamida selenopropargílica selecionada será administrada via intragástrica, e após o melhor tempo da curva tempo-resposta o teste da imersão da cauda será realizado.

Testes ex vivo
Atividade da monoamino-oxidase ex vivo
Os animais serão tratados com uma dose da benzamida selenopropargílica com melhor efeito nos testes de nocicepção e comportamento depressivo. Após o melhor tempo da curva dose-resposta os animais serão mortos por excesso de isoflurano e a atividade da MAO será avaliada conforme Krajl (1965), em preparado de mitocôndrias de cérebro total, conforme Soto-Otero e cols. (2001).

Teste de toxicidade
Para avaliar a possível toxicidade das benzamidas selenopropargílicas, camundongos fêmeas receberão uma única dose oral dos compostos selecionados na dose de 300 mg/kg ou veículo conforme indicado pelas diretrizes da OECD (423, 17 de dezembro de 2001). Serão utilizadas fêmeas com jejum de 3-4h antes da administração e com variação de no máximo 20% do peso corporal, conforme preconizado pela OECD. Os animais serão observados a cada 30 min durante as primeiras 24h e depois diariamente por 14 dias (OECD) para determinar o potencial letal dos compostos.
Após o teste de toxicidade recomendado pela OECD, os camundongos serão anestesiados para o procedimento de punção cardíaca e o sangue será coletado em tubos contendo heparina. O plasma será obtido após centrifugação e usado para ensaios bioquímicos através de kits comerciais. As atividades da aspartato aminotransferase (AST) e alanina aminotransferase (ALT) no plasma serão usadas como indicadores de função hepática (Reitman and Frankel, 1957). A função renal será avaliada pelos níveis plasmáticos de ureia (Mackay and Mackay, 1927). Amostras hemolisadas serão descartadas



Análise estatística
A normalidade dos dados será avaliada pelo teste de D’agostino. Os dados experimentais serão demonstrados como média ± erro padrão. As comparações entre os grupos serão feitas por ANOVA de uma ou duas vias, seguidas pelo teste de Newman-Keuls quando apropriado. Um valor de p<0.05 será considerado significativo.

Espera-se encontrar novas moléculas com propriedades antinociceptiva e do tipo antidepressiva, bem como avaliar seus mecanismos de ação, para futuramente possibilitar o desenvolvimento de novos fármacos. Além disso, esse projeto busca a inserção de alunos de graduação na pesquisa científica a fim de contribuir com o Programa de Pós-Graduação em Bioquímica e Bioprospecção (PPGBBio) da UFPel, formando recursos humanos, como futuros mestrandos e doutorandos do programa. Nesse sentido, pretende-se publicar trabalhos em periódicos internacionais e participar de eventos científicos.