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Diferentes compostos baseados em 4-tiazolidinona (4-TZD) têm sido sintetizados e testados, mostrando-se moléculas promissoras tanto do ponto de síntese química quanto de aplicação biológica (Liesen et al., 2008). Para este projeto, serão sintetizados alguns compostos derivados de 4-TDZ pelo Laboratório de Química Aplicada a Bioativos (LaQuiABio), os quais ainda não possuam atividade biológica descrita na literatura. Objetiva-se, através do desenvolvimento deste projeto, formar e engajar alunos de iniciação científica e de pós-graduação, e de estabelecer uma parceria com o aluno José Coan, membro do LaQuiABio, agregando informações a sua tese de doutorado (PPGBBIO). Além disso, pretende-se trazer resultados pioneiros de aplicação biológica para os compostos 4-TZD analisados.
O que nos motiva a investigar tais compostos é que nos últimos anos os compostos contendo o anel 4-TZD vêm ganhando importância junto à comunidade científica. Vários trabalhos foram e estão sendo desenvolvidos por diferentes grupos de pesquisa, tanto da academia quanto das indústrias farmacêuticas (ou mesmo em trabalho conjunto), com base nesta classe de compostos. Sob o ponto de vista químico, o interesse por estas moléculas deve-se ao baixo custo e à versatilidade de sua síntese (Liesen et al., 2008). Sob o ponto de vista biológico, as 4-TZD apresentam diversas atividades, sendo relatadas como potenciais agentes antimicrobianos, anti-retrovirais, antiinflamatórios, anti-hipertensivos, antipsicóticos, anti-coagulantes, antiprotozoários etc. Com isso, vislumbra-se, a partir desta classe de substâncias, o surgimento de novos fármacos (Liesen et al., 2008). Cabe mencionar que os estudos in vitro são ferramentas importantes para o entendimento da ação biológica de uma dada molécula, e permite que se realize triagens para escolha de compostos promissores, reduzindo o gasto de animais.
O nosso principal objetivo com este projeto é encontrar um derivado de 4-TZD que possua atividade antioxidante e propriedades de inibição da monoamina oxidase (MAO) para que, em breve, seja testado em modelos pré-clínicos de doenças humanas. Para fins de contextualização, é descrito que o estresse oxidativo pode ser causa ou mesmo consequência de doenças envolvendo o sistema nervoso. No entanto, é mais comum que o estresse oxidativo seja uma consequência de patologias. Atualmente, acredita-se que determinadas patologias neurodegenerativas, em sua gênese, têm ligação direta com as espécies reativas. Entre elas encontram-se a doença de Alzheimer e a doença de Parkinson (Porto, 2001). Além disso, doenças psiquiátricas como a depressão também têm sido relacionadas ao estresse oxidativo. Estudos têm sido conduzidos no sentido de prover substâncias com capacidade de controlar o estresse oxidativo como uma possível fonte de futuros medicamentos. A MAO é uma enzima ligada à membrana mitocondrial externa responsável por catalisar a reação de desaminação oxidativa de monoaminas. Entre os substratos da MAO encontram-se neurotransmissores, hormônios e compostos exógenos biologicamente ativos. Devido a isso, a MAO desempenha um papel crítico na regulação de atividades do sistema nervoso central (SNC) e está relacionada ao desenvolvimento de inúmeras desordens neurológicas e psiquiátricas (DROZAK et al., 2006), fundamentadas principalmente no fato de que a catálise origina metabólitos potencialmente tóxicos, como aldeídos e peróxido de hidrogênio (FINBERG et al., 2016). Logo, um aumento da atividade da MAO, o qual pode estar relacionado a algumas patologias, também se relaciona ao aumento dos níveis de espécies reativas e consequentes danos oxidativos. Além disso, inibidores da MAO A e/ou B são atualmente empregados no tratamento de doenças como depressão, Parkinson e Alzheimer, as quais tem relação com o estresse oxidativo.

TRIAGEM IN VITRO: AVALIAÇÃO DE ATIVIDADES BIOLÓGICAS DE COMPOSTOS 4-TZD
Triagens para a avaliação da ação antioxidante e do potencial de inibição da enzima MAO serão realizadas com 3 compostos 4-TZD. Os experimentos serão realizados sempre em duplicatas e em dias diferentes. Conforme o delineamento estatístico, cada teste será repetido de 3-4 vezes (N=3-4).

Ensaios para avaliação antioxidante:
O efeito de diferentes concentrações de 4-TZD sobre os níveis de lipoperoxidação em tecido cerebral in vitro será avaliado pelo ensaio de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) de acordo com Ohkawa, et al (1979). Também será avaliado o efeito de compostos 4-TDZ sobre os níveis de carbonilação de proteínas seguindo Levine, et al (1990).

Ensaios de inibição da atividade da enzima MAO - Isoforma cerebral da MAO:
A capacidade das 4-TZD na inibição das isoformas A e B da enzima MAO em tecido cerebral será avaliado conforme Soto-Otero, et al (2001) utilizando um preparado rico em mitocôndrias.

ESTUDOS SOBRE MECANISMOS ANTIOXIDANTES E DE INIBIÇÃO DA ENZIMA MAO
Após estes ensaios de triagem, será escolhido o composto 4-TZD mais promissor para os ensaios destinados à caracterização de mecanismos de ação, incluindo mecanismos antioxidantes e de inibição da MAO.

Captura de radicais livres: os métodos de DPPH (2,2-difenil-1-picrilhidrazilo) e ABTS [2,2’-azino-bis (3-etilbenzotiazolin) 6-ácido sulfônico] serão usados para testar se o 4-TZD apresenta atividade scavenger de radicais livres, conforme as técnicas de Sharma and Bhat (2008) e Re et al. (1999).

Ensaio de determinação do poder antioxidante de redução do ferro (FRAP): a atividade antioxidante relacionada à capacidade em reduzir o ferro será realizada pelo método FRAP de acordo com Benzie e Strain (1996).

Ensaio de atividade mimética à superóxido dismutase (MAO): a habilidade do composto em inibir a auto-oxidação do pirogalol que é catalisada pelo radical superóxido será analisada de acordo com Marklund and Marklund (1974).

Ensaio de reversibilidade da inibição da MAO por diálise: a reversibilidade da inibição da atividade da MAO-A e B pela 4-TZD escolhida conforme Sampaio e cols. (2016).

Ensaio de cinética enzimática da enzima MAO cerebral: A cinética enzimática de inibição da MAO-A e B será realizada utilizando diferentes concentrações do substrato e da 4-TZD escolhida, conforme Sampaio e cols. (2016).

Experimentos in vivo- toxicidade oral aguda: Para o ensaio de toxicidade, seguiremos o protocolo indicado pela OECD (OECD GUIDELINE FOR TESTING OF CHEMICALS, Acute Oral Toxicity – Fixed Dose Procedure, 2001).

Espera-se com este projeto indicar uma nova molécula com potencial antioxidante, ação inibitória da MAO cerebral e baixa toxicidade para futura aplicação em modelos pré-clínicos de doenças neuropsiquiátricas. Pretende-se também contribuir com a formação de alunos de iniciação científica e de pós-graduação da UFPel.