Nome do Projeto
Caracterização da ação do sistema endocanabinóide sobre a função do oviduto em fêmeas suínas
Ênfase
Pesquisa
Data inicial - Data final
23/06/2020 - 04/02/2022
Unidade de Origem
Coordenador Atual
Área CNPq
Ciências Agrárias
Resumo
O sistema endocanabinóide (SE) foi caracterizado a partir da década de 1960, a partir da extração e da identificação do Δ9-tetrahidrocanabinol (Δ9-THC), a substância psicoativa mais produzida pela Cannabis sativa. Inicialmente, acreditava-se que o Δ9-THC agia difusamente sobre as membranas celulares. Posteriormente, foi demonstrada a ligação de agonistas em receptores canabinóides específicos (CBRs) localizados no cérebro de ratos. Os primeiros estudos a relacionar o SE com a função reprodutiva partiram de observações em animais de laboratório, nos quais a administração de Δ9-THC resultou em efeitos negativos, tais como: prolongamento da gestação; reabsorção embrionária; e partos prematuros. Posteriormente, outros receptores e agonistas endógenos com efeitos em diferentes sistemas foram identificados. Os principais agonistas endógenos do SE são a anandamida (N-araquidonoil-etanolamida ou AEA) e o 2-araquidonoil glicerol (2-AG), ambos sintetizados a partir do ácido araquidônico (Wolf, 2012). Estes agonistas se ligam aos receptores canabinóides 1 (CB1R) e 2 (CB2R) presentes principalmente no sistema nervoso central (CB1R) e no sistema imune (CB2R). O CB1R e outros componentes do SE já foram identificados no sistema reprodutivo, sendo reconhecidos como mediadores de diversos eventos reprodutivos em espécies mamíferas. Os efeitos do SE sobre a função reprodutiva seriam relacionados à supressão do sistema hormonal. Em nível ovariano, existem relatos de envolvimento do SE na patogenia da síndrome do ovário policístico, uma das causas mais comuns de infertilidade em mulheres. A desregulação na produção de endocanabinóides ou nos seus mecanismos de sinalização sobre os receptores no ambiente do oviduto pode resultar na retenção de embriões após a fertilização, inviabilizando o estabelecimento da gestação. Até o momento, estudos que relacionam o SE com o controle do ciclo estral estão concentrados em bovinos. Nesta espécie, os níveis de AEA secretados tanto por células do lúmen do oviduto, quanto por células do folículo ovulatório, flutuam conforme a etapa do ciclo estral, sendo os níveis mais elevados observados durante o período periovulatório. Agonistas do receptor endocanabinóide afetam negativamente a função de células luteais bovinas in vitro, sugerindo um efeito posterior sobre a fertilidade, devido à redução na implantação de embriões. A AEA pode atuar sobre a viabilidade espermática no oviduto, uma vez que espermatozoides possuem receptores CB1 e CB2 na sua membrana plasmática, respondendo a um aumento na concentração de AEA com diminuição na cinética espermática. Além disso, o SE teria capacidade de controlar a interação entre os espermatozoides e a zona pelúcida, inibindo a sua ligação quando a AEA está presente. A espécie suína é um modelo experimental relevante para o estudo da função reprodutiva em espécies multiovulatórias, em função da liberação de dezenas de ovócitos em cada ovulação. Estes ovócitos estão contidos em folículos de diversos níveis de desenvolvimento. No entanto, após as etapas clássicas de recrutamento e seleção, não há divergência folicular. Portanto, mesmo que estes folículos estejam submetidos a um mesmo ambiente endócrino, os mecanismos ativos de seleção e atresia de folículos subordinados envolvem fatores secretados em diferentes segmentos do sistema reprodutivo, os quais podem estar sendo regulados sob influência do SE.

Objetivo Geral

Caracterizar a atuação do sistema endocanabinóide na regulação da função do oviduto em fêmeas suínas.

Justificativa

Até o momento, estudos focados na atuação do SE em suínos abordaram principalmente os sistemas nervoso e digestório. Com relação ao sistema reprodutivo, foram relatados efeitos do SE sobre a função espermática em machos suínos, com envolvimento na inibição de processos como reação acrossômica e capacitação espermática, que são eventos que ocorrem no oviduto da fêmea suína durante o processo de fertilização. Os eventos bioquímicos e fisiológicos sediados no oviduto são regulados pelos distintos ambientes endócrinos que ocorrem em diferentes fases do ciclo estral. As secreções das células das diferentes porções do oviduto contribuem para a composição de microambientes distintos, nas etapas finais de maturação dos ovócitos, na capacitação espermática e para a fecundação. Ao contrário do que ocorre na espécie bovina, a simulação in vitro de procedimentos relacionados à maturação ovocitária e ao controle da polispermia ainda exigem melhor padronização na espécie suína. Existem evidências de que as células do oviduto respondem de maneira diferenciada de acordo com a fase do ciclo estral, devido a níveis distintos de gonadotrofinas e estrógenos, e também de acordo com o segmento do oviduto ao qual pertencem. Porém, informações sobre a função dos tecidos do oviduto na espécie suína em diferentes ambientes endócrinos durante o ciclo estral são escassas, pois a maioria dos estudos conduzidos neste campo utilizou tecidos colhidos em abatedouros, provenientes de fêmeas em fases aleatórias do ciclo estral. Portanto, a caracterização das alterações ocorridas em diferentes segmentos do oviduto sob influência de ambiente endócrinos distintos e suas associações com o SE pode contribuir para o aprimoramento de técnicas de fertilização in vitro na espécie suína.

Metodologia

Fêmeas suínas pré-púberes alojadas no setor de terminação de uma granja comercial serão alocadas aleatoriamente a 4 tratamentos (n = 8 em cada), mimetizando diferentes perfis endócrinos: Perfil pré-púbere (controle), sem tratamento hormonal; Perfil pró-estro: tratamento com 1.200 UI de gonadotrofina coriônica equina (eCG, Folligon®, MSD Animal Health), por via intramuscular (IM), 3 dias antes da data do abate (D -3); Perfil pré-ovulatório: tratamento com 1.200 UI de eCG, 6 dias antes da data programada para o abate (D -6), e com 500 UI de gonadotrofina coriônica humana (hCG, Chorulon®, MSD Animal Health), 3 dias antes da data do abate (D -3), ambos por via IM; Perfil IA: mesmo tratamento do perfil pré-ovulatório, seguido de inseminação artificial (IA), 26-30 h após a administração de hCG. A IA será realizada com sêmen resfriado a 17-18°C, pela via intra-cervical, com 3 x 109 espermatozoides/10 ml.
Os ovários e ovidutos serão colhidos durante o abate e acondicionados a 5°C em um recipiente térmico durante o transporte até o laboratório. Amostras deste material serão conservadas em TRIzol® (Invitrogen), para extração de material genético, ou em solução de formaldeído a 10%, para confecção de lâminas histológicas.
As amostras conservadas em formaldeído a 10% serão desidratadas em um gradiente de etanol e incluídas em parafina. Os blocos obtidos serão cortados em seções de 3,0 µm e 1,5 µm de espessura e submetidos a três protocolos de coloração: Hematoxicilina-Eosina (HE); Coloração Ácido Periódico de Schiff (PAS); e PAS adicionado de Azul de Toluidina. As lâminas serão avaliadas em microscópio óptico, sendo as imagens relativas ao epitélio ampular capturadas com uma câmera acoplada às lentes oculares do microscópio. Das imagens obtidas, serão realizadas medições da espessura do epitélio, da relação células secretoras/células ciliadas e da área total de epitélio nas células de fêmeas dos diferentes perfis, através do software ImageJ®.
As amostras armazenadas em TRIzol® (Invitrogen) serão processadas para extração do RNA total, seguindo as recomendações do fabricante. O RNA extraído será quantificado em um espectrofotômetro (NanoDrop®, Thermo Scientific), com comprimento de onda de 260 nm. A pureza do RNA extraído será avaliada com uma razão de absorbâncias de OD260/OD280, padronizada para valores maiores ou iguais a 1,8. Resíduos de DNA contaminante serão digeridos através de tratamento do RNA total com DNAse (Promega), a 37°C durante 5 min. Após a inativação da DNAse a 65°C por 10 min, a reação de transcrição reversa será conduzida usando o kit iScriptc® cDNA synthesis (BioRad), seguindo as recomendações do fabricante. A expressão gênica relativa será determinada com PCR em tempo real (CFF 384®, BioRad). A variação no conteúdo de mRNA será corrigido pela amplificação dos genes constitutivos GAPDH e Ciclofilina. Das amostras conservadas em parafina, serão obtidos cortes de 5 µm de espessura utilizando um micrótomo automático. Estas amostras serão montadas em lâminas silanadas, secas por 7 dias a 37°C. Posteriormente, as lâminas serão desidratadas, desparafinizadas e incubadas com os anticorpos policlonais de coelho contra as seguintes proteínas: CB1R, CB2R, FAAH, NAPE-PLD e TRVP1, seguindo protocolo utilizado por El-Talatini et al. (2009) e Gervasi et al. (2013).
Após serem coradas por hematoxilina de Mayer, as lâminas serão observadas em microscópio óptico. As imagens serão capturadas sob diferentes aumentos das objetivas: 4X, 10X, 20X, 40X e 100X, e avaliadas através do software ImageJ®. A intensidade da marcação no tecido avaliado será classificada como: ausente (-), presente (+), ou presente e intenso (++).
Os dados referentes à espessura do epitélio, relação células secretoras/células ciliadas, área total de epitélio e abundância de mRNA para cada gene testado serão testados quanto à normalidade e submetidos a transformações, se necessário. Posteriormente, estas respostas serão comparadas entre os distintos perfis endócrinos através de análise de variância, com comparações entre médias conduzidas pelo teste de Tukey. As diferentes categorias de imunomarcação serão comparadas entre os perfis endócrinos através de através de análise de variância de Kruskal-Wallis para dados não-paramétricos.

Indicadores, Metas e Resultados

A caracterização morfométrica deverá agregar maior entendimento sobre as alterações estruturais e funcionais dos diferentes segmentos do oviduto, de acordo com as variações no ambiente endócrino em fases distintas do ciclo estral de fêmeas suínas.
A partir das avaliações de expressão gênica e imuno-histoquímica, espera-se elucidar possíveis interações fisiológicas entre o sistema endocanabinóide e a função do oviduto, gerando conhecimento sobre os processos envolvidos na fertilização na espécie suína.
Este projeto deverá permitir a conclusão de uma tese de Doutorado e de, pelo menos, duas publicações em periódicos científicos, uma vez que este tema ainda não foi estudado anteriormente na espécie de interesse.

Equipe do Projeto

NomeCH SemanalData inicialData final
ARNALDO DINIZ VIEIRA3
BERNARDO GARZIERA GASPERIN2
CAMILA RIBEIRO CARVALHO DE BRITO
CAMILA RIBEIRO CARVALHO DE BRITO
JOSÉ VICTOR CARDOSO BRAGA
LUANA PESCKE SOARES
RAFAEL GIANELLA MONDADORI3
THOMAZ LUCIA JUNIOR9
Ágatha Decroix Cordeiro

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