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Até o momento, estudos focados na atuação do SE em suínos abordaram principalmente os sistemas nervoso e digestório. Com relação ao sistema reprodutivo, foram relatados efeitos do SE sobre a função espermática em machos suínos, com envolvimento na inibição de processos como reação acrossômica e capacitação espermática, que são eventos que ocorrem no oviduto da fêmea suína durante o processo de fertilização. Os eventos bioquímicos e fisiológicos sediados no oviduto são regulados pelos distintos ambientes endócrinos que ocorrem em diferentes fases do ciclo estral. As secreções das células das diferentes porções do oviduto contribuem para a composição de microambientes distintos, nas etapas finais de maturação dos ovócitos, na capacitação espermática e para a fecundação. Ao contrário do que ocorre na espécie bovina, a simulação in vitro de procedimentos relacionados à maturação ovocitária e ao controle da polispermia ainda exigem melhor padronização na espécie suína. Existem evidências de que as células do oviduto respondem de maneira diferenciada de acordo com a fase do ciclo estral, devido a níveis distintos de gonadotrofinas e estrógenos, e também de acordo com o segmento do oviduto ao qual pertencem. Porém, informações sobre a função dos tecidos do oviduto na espécie suína em diferentes ambientes endócrinos durante o ciclo estral são escassas, pois a maioria dos estudos conduzidos neste campo utilizou tecidos colhidos em abatedouros, provenientes de fêmeas em fases aleatórias do ciclo estral. Portanto, a caracterização das alterações ocorridas em diferentes segmentos do oviduto sob influência de ambiente endócrinos distintos e suas associações com o SE pode contribuir para o aprimoramento de técnicas de fertilização in vitro na espécie suína.

Fêmeas suínas pré-púberes alojadas no setor de terminação de uma granja comercial serão alocadas aleatoriamente a 4 tratamentos (n = 8 em cada), mimetizando diferentes perfis endócrinos: Perfil pré-púbere (controle), sem tratamento hormonal; Perfil pró-estro: tratamento com 1.200 UI de gonadotrofina coriônica equina (eCG, Folligon®, MSD Animal Health), por via intramuscular (IM), 3 dias antes da data do abate (D -3); Perfil pré-ovulatório: tratamento com 1.200 UI de eCG, 6 dias antes da data programada para o abate (D -6), e com 500 UI de gonadotrofina coriônica humana (hCG, Chorulon®, MSD Animal Health), 3 dias antes da data do abate (D -3), ambos por via IM; Perfil IA: mesmo tratamento do perfil pré-ovulatório, seguido de inseminação artificial (IA), 26-30 h após a administração de hCG. A IA será realizada com sêmen resfriado a 17-18°C, pela via intra-cervical, com 3 x 109 espermatozoides/10 ml.
Os ovários e ovidutos serão colhidos durante o abate e acondicionados a 5°C em um recipiente térmico durante o transporte até o laboratório. Amostras deste material serão conservadas em TRIzol® (Invitrogen), para extração de material genético, ou em solução de formaldeído a 10%, para confecção de lâminas histológicas.
As amostras conservadas em formaldeído a 10% serão desidratadas em um gradiente de etanol e incluídas em parafina. Os blocos obtidos serão cortados em seções de 3,0 µm e 1,5 µm de espessura e submetidos a três protocolos de coloração: Hematoxicilina-Eosina (HE); Coloração Ácido Periódico de Schiff (PAS); e PAS adicionado de Azul de Toluidina. As lâminas serão avaliadas em microscópio óptico, sendo as imagens relativas ao epitélio ampular capturadas com uma câmera acoplada às lentes oculares do microscópio. Das imagens obtidas, serão realizadas medições da espessura do epitélio, da relação células secretoras/células ciliadas e da área total de epitélio nas células de fêmeas dos diferentes perfis, através do software ImageJ®.
As amostras armazenadas em TRIzol® (Invitrogen) serão processadas para extração do RNA total, seguindo as recomendações do fabricante. O RNA extraído será quantificado em um espectrofotômetro (NanoDrop®, Thermo Scientific), com comprimento de onda de 260 nm. A pureza do RNA extraído será avaliada com uma razão de absorbâncias de OD260/OD280, padronizada para valores maiores ou iguais a 1,8. Resíduos de DNA contaminante serão digeridos através de tratamento do RNA total com DNAse (Promega), a 37°C durante 5 min. Após a inativação da DNAse a 65°C por 10 min, a reação de transcrição reversa será conduzida usando o kit iScriptc® cDNA synthesis (BioRad), seguindo as recomendações do fabricante. A expressão gênica relativa será determinada com PCR em tempo real (CFF 384®, BioRad). A variação no conteúdo de mRNA será corrigido pela amplificação dos genes constitutivos GAPDH e Ciclofilina. Das amostras conservadas em parafina, serão obtidos cortes de 5 µm de espessura utilizando um micrótomo automático. Estas amostras serão montadas em lâminas silanadas, secas por 7 dias a 37°C. Posteriormente, as lâminas serão desidratadas, desparafinizadas e incubadas com os anticorpos policlonais de coelho contra as seguintes proteínas: CB1R, CB2R, FAAH, NAPE-PLD e TRVP1, seguindo protocolo utilizado por El-Talatini et al. (2009) e Gervasi et al. (2013).
Após serem coradas por hematoxilina de Mayer, as lâminas serão observadas em microscópio óptico. As imagens serão capturadas sob diferentes aumentos das objetivas: 4X, 10X, 20X, 40X e 100X, e avaliadas através do software ImageJ®. A intensidade da marcação no tecido avaliado será classificada como: ausente (-), presente (+), ou presente e intenso (++).
Os dados referentes à espessura do epitélio, relação células secretoras/células ciliadas, área total de epitélio e abundância de mRNA para cada gene testado serão testados quanto à normalidade e submetidos a transformações, se necessário. Posteriormente, estas respostas serão comparadas entre os distintos perfis endócrinos através de análise de variância, com comparações entre médias conduzidas pelo teste de Tukey. As diferentes categorias de imunomarcação serão comparadas entre os perfis endócrinos através de através de análise de variância de Kruskal-Wallis para dados não-paramétricos.

A caracterização morfométrica deverá agregar maior entendimento sobre as alterações estruturais e funcionais dos diferentes segmentos do oviduto, de acordo com as variações no ambiente endócrino em fases distintas do ciclo estral de fêmeas suínas.
A partir das avaliações de expressão gênica e imuno-histoquímica, espera-se elucidar possíveis interações fisiológicas entre o sistema endocanabinóide e a função do oviduto, gerando conhecimento sobre os processos envolvidos na fertilização na espécie suína.
Este projeto deverá permitir a conclusão de uma tese de Doutorado e de, pelo menos, duas publicações em periódicos científicos, uma vez que este tema ainda não foi estudado anteriormente na espécie de interesse.