Nome do Projeto
Atividade antimicrobiana, antioxidante, anti-inflamatória e sinérgica de óleos essenciais e de seus constituintes majoritários frente à Candida albicans e Pseudomonas aeroginosa P01 em biofilme formado em material médico hospitalar
Ênfase
Pesquisa
Data inicial - Data final
28/08/2020 - 31/08/2021
Unidade de Origem
Coordenador Atual
Área CNPq
Ciências Biológicas
Resumo
As espécies de Candida são responsáveis por ocasionar infecções fungicas em todo mundo, sendo a C. albicans a espécie mais frequentemente associada a processos infecciosos em paciente hospitalizados. A Pseudomonas aeruginosa é uma bactéria Gram-negativa comumente encontrada no ambiente hospitalar e também causa infecções em pacientes imunocomprometidos. Esses microrganismos são estudados atualmente, devido ao seu grande envolvimento na formação de biofilmes e no aumento da resistência aos antimicrobianos. Neste contexto, o objetivo do presente projeto será avaliar a atividade antimicrobiana e sinérgica dos óleos essenciais (OE) (palmarosa, canela e tomilho) e seus constituintes majoritários (CM) (geraniol, eugenol e timol) frente a biofilme de C. albicans e de P. aeroginosa cepa PA01 formados em materiais médicos hospitalares (sonda uretral e cateter). A caracterização e identificação dos OE serão realizadas por Cromatografia Gasosa (CG) e Cromatografia Gasosa acoplada a massas (CG-MS). O 2,2-difenil-1-picril-hidrazil (DPPH) será utilizado para avaliar a atividade antioxidante dos OE e dos CM. A concentração inibitória mínima (CIM) e a concentração fungicida mínima (CFM) e concentração bactericida mínima serão avaliadas pelo método de microdiluição em placa utilizando uma cepa de C. albicans (ATCC 14053) e P. aeroginosa cepa PA01, respectivamente. O efeito dos OE e dos CM no crescimento desses microrganismos será avaliado com a realização de curva de morte em relação ao tempo e o efeito sinérgico será determinado conforme descrito por RONDEVALDOVA et al., (2015). A formação do biofilme nos materiais médicos hospitalares ocorrerá de acordo com as condições previamente descritas por GIONGO et al. (2016) com modificações. A atividade antibiofilme após tratamento com OE e os CM será avaliada através do ensaio de cristal violeta, safranina, determinação das proteínas totais e microscopia de força atômica (AFM). Parâmetros inflamatórios e oxidativos serão avaliados em cultura de macrófagos murino RAW 264.7, onde as células serão estimuladas utilizando as cepas dos microrganismos descritos acima na concentração de 1,5x108 UFC por poço. Após tratamento com OE e CM durante 24 horas os sobrenadante serão removidos e avaliados. Serão determinados os níveis de TNFα, IL-6 e IL-10, conforme descrito por GIONGO et al. (2017), óxido nítrico (NO), conforme TATSCH et al. (2011) e a taxa de produção de radicais livres utilizando a sonda fluorescente, 2,7’- diclorofluoresceína (DCF), segundo (HALLIEWLL e WHITEMAN, 2004). Os níveis de expressão gênica da COX-2 e iNOs serão determinados como descrito por GIONGO et al. (2017) após extração do RNA dos macrófagos. Com os resultados deste projeto, espera-se identificar a capacidade desses OE ou dos CM em diminuir ou previnir de forma efetiva a formação de biofilmes nesses materiais médicos hospitalares. Tal efeito, será avaliado de forma isolada ou sinérgica representando, portando, uma alternativa para a inibição da formação de biofilmes nesses materiais.

Objetivo Geral

- Avaliar a atividade antimicrobiana e sinérgica dos óleos essenciais de palmarosa, canela e tomilho e seus
constituintes majoritários (geraniol, eugenol e timol) frente a biofilme de Candida albicans e de Pseudomonas
aeroginosa cepa PA01 em material médico hospitalar (sonda uretral e cateter).

Justificativa

A relevância desta proposta reside no fato de que tais óleos e seus constituintes majoritários de forma isolada ou sinérgica podem constituir uma estratégia terapêutica interessante para ser empregada em material médico-hospitalar (cateter, sonda uretral, sonda naso-gástrica e sonda entero-gástrica) como agentes antibiofilme, na tentativa de minimizar infecções hospitalares. Cabe ressaltar que além de não haver estudos específicos sobre a utilização desses óleos para inibir a formação de biofilmes, o estudo do sinergismo e a utilização de seus constituintes majoritários com seu emprego em modelos de formação de biofilme em material médico hospitalar pode ser considerada uma área pouco explorada e também que apresenta um promissor campo de estudos para a avaliação de novos compostos bioativos, fato este, que configura a originalidade da proposta aqui apresentada.

Metodologia

- Aquisição dos óleos, constituintes majoritários e materiais médicos hospitalares
Os óleos essenciais de palmarosa, canela e tomilho serão adquiridos comercialmente da empresa Ferquima Indústria e Comércio de óleos essenciais (Vargem Grande Paulista – SP). Os constituintes majoritários geraniol, eugenol e timol serão adquiridos da empresa Sigma-Aldrich (Brasil). Os materiais médicos hospitalares (sonda uretral e cateter) serão adquiridos de empresas especializadas do ramo médico.
- Caracterização dos óleos essenciais
A caracterização dos óleos essenciais será realizada na Universidade Federal de Pelotas (UFPel), no curso de Química, sendo responsável pelas análises a Dra. Márcia Foster Mesko. Após preparação dos óleos essenciais os mesmos serão submetidos à análise por CG e CG-MS.
- Sequestro de radicais DPPH
O 2,2-difenil-1-picril-hidrazil (DPPH) será realizado de acordo com o método descrito por CHEN e col. (2003). - Microrganismos A cepa de Candida albicans (ATCC 14053) adquirida da Amercian Type Culture Collection e a bacterária Pseudomonas aeroginosa cepa PA01 serão utilizadas nesse projeto. Estes microrganismos serão mantidos em meio de cultura com glicerol e congelados a -80°C. As amostras descongeladas serão inoculadas em caldo Brain Heart Infunsion (BHI) e incubadas por 24 horas. Após, serão semeadas em agar Sabouraud para fungo e ágar BHI para a bactéria, e novamente incubada por 24 horas a 37 °C antes da realização dos experimentos. - Concentração Inibitória Mínima (CIM), Concentração Fungicida Mínima (CFM) e Concentração Bactericida Mínima (CBM). A CIM será avaliada pelo método de microdiluição em placa de 96 poços utilizando conforme descrito por GIONGO et al. (2016). Para determinar a CFM e CBM uma alíquota de 1 µL será retirada de cada poço, semeada em agar Sabouraud para fungo e BHI para bactéria e incubada por 24 horas a 37 °C. Após, as colônias serão identificadas e a menor concentração que não demonstrar crescimento microbiano será considerada a CFM e CBM, respectivamente.
- Efeito dos óleos e dos compostos majoritários no crescimento da C. albicans e P. aeroginosa PA01
As curvas de crescimento serão observadas inoculando os óleos e os constituintes majoritários em placas de 96 poços com caldo Mueller-Hinton, com 1,5 x 108 UFC/mL de C. albicans e P. aeroginosa P01, sendo tratados com diferentes concentrações dos óleos e constituintes majoritários (1/2x CIM, CIM e 2x CIM). A placa será incubada por 30 horas a 37 °C e a absorbância será determinada em 600 nm (SONDI; SALOPEK-SONDI, 2004).
- Atividade sinérgica
Para a realização destes testes serão preparadas duas placas de microtitulação com 50 µl de caldo Mueller-Hinton (Sigma-Aldrich Co. (St Louis, EUA) em cada poço, uma placa recebera 50 µl da diluição do composto de teste A e a outra a diluição do composto de teste B. Neste caso esses compostos poderão ser os óleos essenciais e/ou compostos majoritários. A maior concentração utilizada será de 4 vezes o valor CIM anteriormente determinado, sendo realizada uma diluição seriada e a leitura dos experimentos conforme descrito por RONDEVALDOVA et al., (2015).
- Formação do biofilme
O biofilme em material médico hospitalar (sonda uretral e cateter) de C. albicans e P. aeroginosa serão formados de acordo com condições previamente descritas (GIONGO et al. 2016) com algumas modificações. Culturas com crescimento exponencial de C. albicans e P. aeroginosa P01 serão diluídas até 106 UFC/ml. Após, 50 µl desta suspensão será adicionada em placa de 16 poços (Nunclon™ D surface, Nunc, Roskilde, Denmark), contendo 500 µl de caldo Sabouraud para fungo ou BHI para bactéria por poço. Após serão adicionados os corpos de prova (sonda e cateter) com 10 mm de comprimento. As placas serão então incubadas por 24 horas a 37°C, sob agitação de 150 rpm. Microscopia de força atômica (AFM) será utilizada ao final do experimento para a visualização dos biofilmes formados. - Eficiência dos óleos e constituintes majoritários frente aos biofilmes formados Após a formação dos biofilmes, serão realizados os tratamentos e a incubação por 24 horas a 37°C, de acordo com GIONGO et al (2016). Um controle positivo de crescimento será realizado contendo caldo BHI com C. albicans e P. aeroginosa PA01 enquanto o controle negativo foi somente caldo BHI. - Quantificação da biomassa do biofilme Após os tratamentos, os sobrenadantes serão removidos e o material médico hospitalar será lavado 4x com PBS para a realização da quantificação. O resultado do biofilme tratado será determinado após fixação com metanol a 95% e corando com 500 µl de cristal violeta a 0,1% ou safranina a 1% por 10 minutos a temperatura ambiente (TA). Etanol a 95% será adicionado para dissolver a coloração e após 10 minutos, será transferido a uma nova placa para medir espectrofotometricamente a 570 nm para o cristal violeta e 492 nm para a safranina em leitor de microplacas. A formação do biofilme será determinada pela diferença entre a média da densidade óptica (DO) obtida no controle positivo (caldo BHI + C. albicans e P. aeroginosa) e o tratamento com os óleos ou constituintes majoritários. Será ainda determinada a concentração de proteínas totais conforme descrito por GIONGO et al. (2016).
- Microscopia de AFM
A microscopia de força atômica (MFA) será realizada na Universidade Federal do Pampa (UNIPAMPA), campus Bagé, com supervisão do professor Dr. André Gündel. Para visualização do biofilme na superfície da sonda e cateter os mesmos serão fixados com metanol absoluto durante 1 minuto. As imagens serão obtidas utilizando um microscópio Agilent Technologies 5500 (CHATTERJEE et al., 2014).
- Cultura, estimulação e tratamento dos macrófagos
Para a realização da cultura será utilizada a linhagem de macrófago murino RAW 264.7 (ATCC TIB-71), conforme descrito por GIONGO et al., (2016). Para estimular os macrófagos serão utilizadas as cepas de C. albicans e P. aeroginosa PA01 na concentração de 1,5x108 UFC por poço. Decorridos 4 horas após incubação, serão utilizados para o tratamento as concentrações de óleos essenciais e/ou constituintes majoritários que apresentaram melhores resultados nos ensaios de atividade antibiofilme. O tratamento será realizado durante 24 horas e após o sobrenadante resultante será removido e utilizado para dosagem dos parâmetros inflamatórios e oxidativos. - Parâmetros inflamatórios e oxidativos. Serão avaliadas as atividades do TNFα, IL-6 e IL-10 utilizando kit Quantikine Mouse Immunoassay, conforme descrito por GIONGO et al. (2017). O óxido nítrico (NO) dos sobrenadantes serão determinados no equipamento automatizado Cobas Mira® usando o método de Griess modificado por TATSCH et al. (2011). A taxa de produção de radicais livres será monitorada através o uso de uma sonda fluorescente, a 2,7’- diclorofluoresceína (DCF), segundo (HALLIEWLL e WHITEMAN, 2004).
- Análise da Expressão Gênica de COX-2 e iNOs
O RNA total dos macrófagos após 24 horas de tratamento serão isolados diretamente dos poços das microplacas após a lavagem para remoção de restos celulares, fungos ou bactérias, sendo utilizado o reagente TRIZOL® (Invitrogen, Carlsbad, CA) de acordo com as instruções do fabricante. Os níveis de expressão da COX-2 e do iNOs serão determinados como descrito por GIONGO et al. (2017).
- Análise estatística Para os ensaios de atividade antimicrobiana, atividade antioxidante e formação de biofilmes será utilizado o teste T de Student. O nível de significância será fixado em 5%. Para os ensaios que utilizaram os macrófagos, determinação da atividade anti-inflamatória e expressão gênica será utilizado ANOVA de 1 via, seguida pelo teste de Dunnett. Os gráficos serão realizados no software Graphpad prism (Graphpad Software, INC).

Indicadores, Metas e Resultados

Como metas esperamos realizar a formação de recursos humanos nos programas de Pós-Graduação que o orientador está vinculado. PPGBBio e PPGMPA. Fomentar o interesse de alunos de graduação pelo interesse em pesquisa. Oreintar alunos de TCC e IC.
A partir dos objetivos propostos e da metodologia que será empregada no projeto espera-se como resultados preliminares, confirmar os constituintes majoritários presentes nos óleos de palmarosa, canela e tomilho. Também espera-se que a atividade antimicrobiana desses óleos e dos constituintes majoritários (geraniol, eugenol e timol) sejam evidenciadas frente a C. albicans e P. aeroginosa cepa PA01, semelhante ao reportado na literatura. A atividade antioxidante dos óleos e dos constituintes majoritários também deve ser confirmada, uma vez que, essa propriedade em um segundo momento do projeto, demonstraria o efeito anti-inflamatário “in vitro” em um modelo de estimulação de macrófagos murinos. Dessa maneira, a avaliação a atividade anti-inflamatória dos óleos e constituintes majoritários serão determinadas de forma isolada ou sinérgica. Em relação aos resultados referentes à atividade antibiofilme, os óleos e os constituintes majoritários, serão avaliados tanto de forma isolada, tanto de forma sinérgica em biofilmes formados em sonda uretral e cateter. Espera-se que pelo menos um dos três óleos testados ou um dos constituintes majoritários de forma isolada ou sinérgica, sejam capazes de reduzir a formação do biofilme nesses materiais. Esse resultado já seria importante, uma vez que, os estudos com biofilmes em material médico hospitalar são restritos, sendo um campo de pesquisa promissor, necessitando ser melhor explorado. Para o desenvolvimento de materiais que apresentem atividade antimicrobiana e anti-inflamatória estes estudos preliminares são cruciais. Com os resultados da atividade anti-inflamatória dos macrófagos murinos que serão estimulados pela C. albicans e P. aeroginosa PA01, e posterior tratamento com os óleos e constituintes majoritários, espera-se observar a resposta celular similar a uma resposta inflamatório no sítio local. Tal processo, mimetizaria a presença desses microrganismos nesse sítio infeccioso em uma situação semelhante a que ocorre durante a formação de biofilme em material médico hospitalar. Esse fato poderia demonstrar a atividade desses macrófagos durante o processo inflamatório local. Dessa maneira, a determinação de citocinas inflamatórias como TNF-alfa, IL-6 e anti-inflamatórias como a IL-10, assim como, através da expressão gênica da COX-2 e iNOs poderiam fornecer resultados interessantes para um melhor entendimento desse processo ‘in vitro”. Por fim, espera-se a partir desses resultados, caso sejam positivos e significativos, que os mesmos possibilitem o registro de patente institucional ou publicação dos resultados.

Equipe do Projeto

NomeCH SemanalData inicialData final
CRISTIANE TELLES BAPTISTA
EDILA MARIA KICKHOFEL FERRER1
JANICE LUEHRING GIONGO
LIZIANE DOS SANTOS ROCHA
MAGDA ROSIANE ROCHA DE ARAUJO
RODRIGO DE ALMEIDA VAUCHER4
Victor dos Santos Barboza

Fontes Financiadoras

Sigla / NomeValorAdministrador
FAPERGS / Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado Rio Grande do SulR$ 28.000,00Coordenador

Plano de Aplicação de Despesas

DescriçãoValor
339030 - Material de ConsumoR$ 15.000,00
449052 - Equipamentos e Material PermanenteR$ 13.000,00

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