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A técnica de criopreservação seminal é basicamente simples de ser desenvolvida, porém importante para a conservação das espécies, como forma de preservação da biodiversidade (MARTÍNEZ-PÁRAMO et al, 2009). Tal técnica pode ser utilizada para proteção das linhagens e como uma ferramenta útil para facilitar a reprodução animal. Estudos dessas técnicas tem sido amplamente desenvolvidos e aplicados aos peixes nos últimos anos, devido ao grande investimento em reprodução por parte da piscicultura, proporcionando benefícios como contínuo fornecimento de semen de boa qualidade para fertilização artificial (VARELA et al. 2012), sendo cruciais para a conservação de recursos aplicados a aquicultura. Além disso, a técnica possibilita a criação de bancos de germoplasma, pois permite a conservação da diversidade genética e reposição de espécies ameaçadas de extinção (VIVEIROS et al. 2009, MARTÍNEZ-PÁRAMO et al. 2009, MARIA et al. 2012).
No entanto, estas células congeladas podem ser danificadas pela toxicidade de crioprotetores, resultando em danos ao DNA, mitocôndria, bem como outras lesões (OGIER DE BAULNY et al, 1997; CABRITA et al, 1998; BABIAK et al, 2001; LAHNSTEINER et al, 1996; CABRITA et al, 2005; DROKIN et al, 1998). Estes danos nem sempre são ultra-estruturais, podendo ser expressos em várias fases, tais como a motilidade do esperma, fertilização ou capacidade de desenvolvimento. Isto acontece no processo de congelamento e descongelamento dos espermatozóides, onde podem ser gerados efeitos nas células espermáticas como, por exemplo, a formação do cristal de gelo, onde, devido ao choque térmico causado pelo rápido reestabelimento do metabolismo celular após o descongelamento, são evidenciados danos funcionais bioquímicos, redução de motilidade, viabilidade e dificulta a fertilização. (LEBOEUFET et al, 2012). O estresse oxidativo, por sua vez, tem sido destacado nos últimos anos no que se refere a tais danos (THUWANUT et al, 2008). Desta forma, alguns estudos demonstraram que a técnica de criopreservação induz o aumento na produção de Espécies Reativas de Oxigênio - ROS (CHATTERJEE & GAGNON, 2001; MAZZILLI et al, 2008; MICHAEL et al, 2007; TSELKAS et al, 2000) e diminuiu a taxa de antioxidantes (BILODEAU et al, 2000; MARTI et al, 2008). Sabe-se que elevados níveis de ROS podem danificar lipídios, proteínas e DNA, e, assim, poderia ser responsável pela redução da viabilidade de espermatozóides criopreservados.
Por esta razão, diferentes crioprotetores e diluentes têm sido amplamente utilizados nos protocolos de congelamento de semen, pois reduz a temperatura de congelamento da célula, impedindo a formação de cristais de gelo intra (penetrantes) e extracelular (não penetrantes) (CARNEIRO 2007). Os crioprotetores mais utilizados em sêmen de peixes Characiformes são: a) Intracelulares: Dimetilsulfóxido (DMSO), metilglicol (MG), metanol, propilenoglicol, dimetilacetamida (DMA), dimetilformamida (DMF) e metilformamida (MF); b) Extracelulares: gema de ovo e lactose. Assim, partir da técnica de criopreservação é possível destacar a importância dos crioprotetores penetrantes e não penetrantes, que podem oferecer efeitos nas celulares espermáticas, causando redução de danos induzidos no pré e pós congelamento (CORCUERA et al, 2007). No entanto, durante a criopreservação, alguns fatores podem alterar o estado fisiológico dos espermatozóides, tais como a composição do diluente, as taxas de congelamento e descongelamento, além do próprio crioprotetor utilizado, tendo em vista sua concentração (LAHNSTEINER et al, 1995; CHAO & LIAO, 2001). Os crioprotetores penetrantes, tais como Dimetil Sulfóxido (DMSO) e Metanol (MeOH), tem sido comumente usado na criopreservação de semen de peixes, trazendo bons resultados em seus experimentos (CAROSFELD et al., 2003). Entretanto, tais estudos confirmar que um crioprotetor penetrante pode melhorar motilidade do esperma e por sua vez a fertilização, quando associado a crioprotetores não penetrantes, por exemplo, açúcar ou proteína.
Alguns autores afirmam que os crioprotetores não penetrantes, como os açúcares, protegerem a membrana celular a partir do volume celular no congelamento e descongelamento (SILVA et al, 2015), sendo benéfico em muitas espécies, como o carneiro (AISEN et al 1995; SÁNCHEZ-PARTIDA et al 1992; JAFAROGHLI et al, 2011), cabra (ABOAGLA & TERADA, 2003; touro (FOOTE et al, 1993), e ratos (STOREY et al, 1998). Entre os açucares utilizados como não penetrantes, destaca-se a utilização de sacarose como um crioprotetor mais efetivo (MOCE e VICENTE, 2009). Esses crioprotetores, promovem a desidratação celular e influenciam a cristalização padrão de água (NICOLAJSEN & HVIDT, 1994), o que contribui para a redução da formação de cristais de gelo na célula (AISEN et al, 2002; CROWE et al, 1998). Conforme Malo et al (2010), a adição de açúcares como extensor de congelamento antes do congelamento, por manter a pressão osmótica, contribuindo para a desidratação celular, agindo de fato como crioprotetor, e após descongelamento com atuação sobre a integridade da membrana espermática, onde as moléculas são capazes de fornecer energia suficiente para os espermatozóides para que ocorra fertilização. Os efeitos destes crioprotetores também são evidenciados, por exemplo, a partir da restauração da pressão osmótica com base na diluição durante descongelamento, onde esta pressão é restaurada aos valores normais. Desta forma, devido características do semen, tais como morfologia e fisiologia, variar entre as espécies, o desenvolvimento desses protocolos torna-se muito mais exigido para a criopreservação de semen de espécies específicas. Tais protocolos dependem da padronização através da determinação de diluentes e crioprotetores mais eficazes para a espécie em questão mantendo a alta qualidade do descongelado assim como é quando fresco (LAHNSTEINER et al, 1995; GLOGOWSKI et al, 1999).
Por outro lado, os diluidores também trazem uma grande importância no processo de criopreservado. Assim, para que o sêmen possa ser criopreservado é necessário que seja adicionado uma solução diluidora, que é composta por um diluente, com a função de diluir e de fornecer nutrientes, e por crioprotetor intracelular e extracelular, com o intuito de permitir o armazenamento adequado e proteger os espermatozoides contra o choque térmico (Salmito-Vanderley et al., 2012; Maria & Carneiro, 2012). As condições exigidas para que o diluidor possa atuar de forma eficaz são: isotonicidade (que não ative a motilidade espermática), estável ao longo do armazenamento, estéril e carreador de crioprotetores (Maria, 2005). Alguns autores citam diluentes já utilizados no processo de criopreservação do sêmen de peixes Characiformes, tais como: glicose, NaCl, BTS® , água de coco, água de coco em pó (ACP® ), Saad, Merck III, Ringer e Kurokura. No entanto há uma grande variação entre eles, quando combinados com os crioprotetores, pois este processo irá atuar de forma que evite a formação de cristais de gelo intracelular, diminuindo estresse osmótico por meio da reposição de água necessária para manutenção do volume celular, interagindo com íons e macromoléculas, reduzindo o ponto de congelação da água, assim como servir como tampão ajustando as alterações do pH (Soares & Guerra, 2009; Medeiros et al., 2002). De acordo com Watson (2000), o protocolo de criopreservação tem uma série de tensões potencialmente prejudiciais às células. Por um lado, a mudança de temperatura, que pode afetar as estruturas presentes nas membranas, como as proteínas; em segundo, as tensões osmóticas e tóxicas apresentadas pela exposição aos crioprotetores, e em terceiro, a formação de cristais de gelo e a dissolução de gelo no meio extracelular. Logo, a fim de verificar a eficiência do protocolo utilizado, Cabrita et al. (2010) ressaltaram a importância da avaliação da qualidade do sêmen usando as ferramentas disponíveis, tais como testes de viabilidade, o teor de ATP, a análise da motilidade, a integridade do DNA entre outros. De fato, esta análise bem feita será decisiva para a seleção de amostras com um bom sêmen e para a padronização de protocolos de criopreservação adequados para cada espécie.
Atualmente, mais de 17 espécies de peixes já têm seu protocolo de criopreservação de semen determinado, por exemplo, pertencentes às famílias Characidae, Prochilodontidae, Anastomidae e Pimelodidade (CAROSFELD et al, 2003; VIVEIROS & GODINHO, 2009).

Serão coletados sêmen de 15 animais de cada espécie a ser trabalhada neste projeto. O material biológico de todos animais será disponibilizado pela propriedade de piscicultura Panamá, localizada no município de Paulo Lopes – SC. Estes animais serão induzidos hormonalmente com extrato de hipófise de carpa e, após 12 horas, serão conduzidos a coleta do sêmen, através de massagem abdominal. Para que não ocorra nenhum tipo de contato entre o material e a água, evitando desta forma a ativação do sêmen, todos animais serão previamente secos.
De imediato após obtenção do material, o semen será avaliado em microscópio de contraste de fase, em lamina sob lamínula. Apenas as amostras que obtiveram 80% ou mais de motilidade após 10 segundos de ativação foram congeladas. Amostras que não apresentaram esse padrão e que foram contaminadas com fezes, urina ou que foram ativadas foram descartadas. Logo após o conteúdo coletado foi armazenado em tubos falcon, mantidos em isopor com temperatura de 8°C.
Em seguida, o semen será adicionado na proporção 1:9 (v/v), às soluções diluidoras de acordo com o protocolo de cada espécie a ser coletada, com seus devidos pH e hosmolaridade já ajustados (Tabela 1). Neste diluidores será adicionado os diferentes tratamentos de crioprotetores, também definidos previamente através do protocolo de cada espécie (Tabela 1). Após, as amostras serão envasadas em palhetas de 0,25µl, devidamente identificadas, vedadas com álcool polivinílico e armazenadas em raques de metal. As amostras devem deixadas a temperatura ambiente por 20 minutos, para maior contanto entre o semen e os tratamentos; em seguida as raques são colocadas em botijão Dryshipper com vapor de nitrogênio a -70°C por 12 horas, e transferidas para botijão de nitrogênio líquido a -196°C.
Após 60 dias, as palhetas de cada espécie com seus devidos tratamentos, serão descongeladas em banho-maria a 45°C por 8 segundos, o conteúdo das mesmas foram colocados em eppendorfs e armazenados resfriados em caixa de isopor com gelo. Serão realizadas as análises de movimentação celular (motilidade e tempo de motilidade) pelo Computer Assisted Semen Analysis (CASA), usando o software Sperm Vision ® (Minitube). Para obtenção dos dados, serão capturados 10 campos tendo ao final no mínimo 500 células. Os parâmetros para avaliação cinética, foram motilidade total (%), motilidade progressiva (%), distância média percorrida DAP (µm), distância curvilínea DCL (µm), distância retilínea DSL (µm), velocidade média do percurso VAP (µm/s), velocidade curvilínea VCL(µm/s), velocidade retilínea VSL (µm/s), retilinearidade STR (VSL / VAP, %), linearidade LIN (VSL / VCL, %), oscilação (WOB), deslocamento lateral da cabeça ALH (µm), frequência de batimento cruzado BCF(Hz). O tempo de motilidade, ou a duração da motilidade, uma vez que realizada a ativação, com a utilização de água Milli Q, será avaliado pela interrupção total da circulação progressiva de espermatozóides, seguindo o método descrito por Sorensen Júnior (1979). Este método caracteriza-se em verificar a característica de cada esperma e exclui aqueles espermatozóides não-móveis da amostra (indicativos de morte espermática).
A análise das estruturas celulares (integridade de DNA, membrana, mitocôndria, fluidez de membrana e espécies reativas de oxigênio) será realizada através da citometria de fluxo AttuneAcousticFocusing ® (Life Technologies) composto por dois lasers, sendo um azul (Argônio 488 nm) e outro violeta (UV 405 nm). Para a detecção da população de espermatozóides, eventos não-espermatozóides são removidos por parcelas FSC SSC dispersão (Petrunkina et al, 2005;Piehler et al, 2005) e para a eliminação de detritos foi utilizada a coloração das células pelo Hoechst 33342 numa concentração de 16,2 mM (Sigma - AldrichCo. - St. Louis , MO , EUA), exceto para o índice de fragmentação do DNA.

3.1 Integridade de membrana

Para avaliação da integridade de membrana, serão utilizados fluoróforos Sybr14 e iodeto de propídio (IP) (Minitübe, Tiefenbach, Germany). Assim, através das amostras de sêmen descongelado, são confeccionadas alíquotas misturadas com as devidas sondas fluorescentes (0,25 µM de Sybr14 e 7,5 µM IP conforme instruções do fabricante – Minitübe) e incubadas por 5 minutos. Para a classificação, foram considerados espermatozoides não lesados, aqueles com membrana funcional (Sybr + / IP-) e lesados aqueles espermatozoides com membrana não funcional (Sybr + / IP +; Sybr- / IP +; Sybr- / IP-) (Figueroa et al 2015).

3.2 Fluidez de Membrana

Para análise de fluidez de membrana foram utilizados 2,7 µM de merocianina hidrofóbico 540 (M540) e 0,1 µM de YO PRO-1 (Invitrogen - Eugene, OR, EUA), adicionado a 10 µL de amostra descongelada incubados por 5 min. Para avaliação, foram classificadas células espermáticas com fluidez alta (alta concentração de M540) e células espermáticas com fluidez baixa (baixa concentração de M540). Para calcular a taxa de fluidez de membrana foi utilizado número de espermatozoides com baixa fluidez, dividindo pelo número de espermatozoides com baixa fluidez, somados aos espermatozoides com alta fluidez *100. Para esta avaliação, são considerados apenas espermatozoides íntegros, ou seja aqueles demarcados com fluoróforo YO-PRO negativo, (Fernández-Gago et al 2013).

3.3 Funcionalidade Mitocondrial

Para avaliação da funcionalidade mitocondrial, foi utilizada uma sonda específica contendo 3,1 µM de Rhodamina 123 (fluorescência verde) e 7,5 µM de IP em 10 µL de amostra descongelada por 5 min. A classificação funcional das células se dá em alta e baixa funcionalidade, ou seja, alta fluorescência pela acumulação de Rhodamina e baixa fluorescência pela acumulação de Rhodamina. Desta forma, apenas espermatozoides intactos (IP negativo) são avaliados (Liu et al 2015). Através do cálculo (número de espermatozoides com alto potencial de membrana mitocondrial/ número de espermatozoides alto potencial de membrana mitocondrial + espermatozoides com baixo potencial de membrana mitocondrial *100), é obtida a taxa de funcionalidade de mitocôndria.

3.4 Índice de fragmentação de DNA

A integridade de DNA será avaliada pelo ensaio da estrutura de cromatina (SCSA). Assim, 10µL das células espermáticas descongeladas são demarcas com 5µL de TNE (0.01 M Tris-HCl; 0.15 M NaCl; 0.001 M EDTA; pH 7,2), 10µL de Triton 1X (Triton X-100, 1%) (v / v) com intervalos de 30 segundos, para verificação desse parâmetro. Logo após, é adicionado e incubado por 30 segundos, o corante acridineorange, não ultrapassando o tempo de 2 minutos para fazer a leitura. Já a classificação espermática se dá atráves de integridade e fragmentação (Jenkins et al 2015), sendo DNA integro (verde) e DNA fragmentado (laranja/vermelho). Para obtenção da taxa desta avaliação, se é calculado através do número de espermatozoides com DNA fragmentado/número de espermatozoides DNA integro + espermatozoides com DNA fragmentado *100.
Para a leitura dos parâmetros, todas as células serão coradas com fluoróforos e logo após, adicionado PBS livre de cálcio (80g de NaCl, 11,5gde KCl, 24g de Na2HPO4, 2g de KH2PO4 em 1L água milique). Um total de 10.000 eventos por amostra de esperma com um fluxo de 200 células/s.

3.5 Análise Estatística
Neste trabalho, os dados descritivos (média e erro padrão da média) serão gerados de cada uma das variáveis dependentes, sendo eles: integridade da membrana plasmática, índice de fragmentação do DNA e da fluidez da membrana plasmática, motilidade total de esperma, funcionalidade mitocondrial, espécies reativas de oxigênio (ROS), motilidade total e progressiva do esperma, e seu tempo de motilidade. Para todas variáveis dependentes serão realizadas a análise normal pelo teste de Shapiro – Wilk e teste de Kruskal Wallis para os dados não paramétricos. Será utilizado o software Statistix® 2009.

4. Experimentos:

Experiência 1: Neste primeiro, como uma investigação preliminar, serão selecionados os principais diluentes utilizados em criopreservação seminal, como BTS, Gema de Ovo, entre outros.

Experiência 2: A partir do primeiro teste,, será investigado neste experimento o efeito protetor dos crioprotectores, este experimento será delineano através do fatorial 4 x 5, onde se analisará o tipo de crioprotetor (Álcoois) em 6 concentrações (2,5 / 5,0 / 7,5 / 10,0 / 12,5 / 15%) ao diluente de congelação.

Experiência 3: Neste experimento, se determinará o efeito protetor de diferentes amidas nas concentrações de 2,5, 5,0 , 7,5 , 10,0, 12,5 e 15%) com 3 concentrações de gema de ovo (4,5, 9,0, 18,0% v / v) no diluente de congelação.

Experiência 4: O efeito dos antioxidantes como crioprotetores, através de diferentes concentrações serão testados diluente de congelação.

Experiência 5: O Experimento 5 será realizado para verificar, a partir de resultados dos experimentos anteriores (Experimento 1, 2 3 e 4), o efeito protetor de combinações de três crioprotetores em suas melhores concentrações, adicionados aos meios de congelação

Nós iniciamos os estudos envolvendo aspectos reprodutivos no ano 2005. Os primeiros resultados sobre crioprotetores está publicado no periódico “Theriogenology” no artigo intitulado “Evaluation of amides and centrifugation temperature in boar semen cryopreservation”. Outro interessante manuscrito sobre a utilização do LDL foi publicado no periódico “Animal Reproduction Science” no artigo intitulado “Effect of low density lipoprotein on the quality of cryopreserved dog sêmen”.
Científica
A partir dos resultados obtidos espera-se, ao final do projeto, produzir um protocolo (diluente seminal e método de congelação) de alta qualidade. Podendo ser utilizado em pisciculturas comerciais, centros de pesquisa e até mesmo em trabalhos de campo. Para uso em programas de melhoramento genético da espécie, formação de banco de germoplasma no intuito de preservação da diversidade genética dos animais da natureza.
Tecnológica
Se confirmada a qualidade deste protocolo, este poderá ser utilizado também como uma ferramenta de prestação de serviços para a piscicultura comercial de Tambaqui, contribuindo para a geração de recursos financeiros e para a formação de recurso humanos, bem como para geração de publicações técnico-científicas. Assim como maior retorno econômico ao piscicultor, pela otimização do material genético masculino, não sofrendo interferência do meio.