Portal InstitucionalUFPEL

R. microplus ou “carrapato do boi” é um ácaro hematófago, presente em regiões tropicais e subtropicais (WILLADSEN; JONGEJAN, 1999). Primeiramente foi classificado dentro do gênero Boophilus (do grego: “amigo do boi”), designação introduzida em 1891 por Curtice, que hoje é aceita como subgênero. Apresenta-se como um importante vetor de arboviroses, rickettsioses, espiroquetoses e protozooses para o homem e animais domésticos (KAUFMAN, 1989; PATARROYO, 1994). Para a pecuária bovina brasileira, os agentes transmitidos por este carrapato que causam maior impacto são rickettsias do gênero Anaplasma e protozoários do gênero Babesia, responsáveis pelo complexo conhecido como “tristeza parasitária bovina” (TPB) (Andreotti e Koller, 2013).
O carrapato R. microplus causa prejuízos diretos e indiretos à produção de bovinos. Os prejuízos diretos são determinados por vários motivos, dentre os principais, citam-se: a ingestão de sangue durante sua alimentação comprometendo a produção de carne e leite em diferentes níveis; a inoculação de toxinas no hospedeiro promovendo diversas alterações e consequências fisiológicas, como inapetência; a transmissão de agentes patogênicos como espécies dos gêneros Anaplasma e Babesia, responsáveis pela TPB; e a redução da qualidade do couro do animal, devido às cicatrizes irreversíveis ocasionadas durante o repasto do artrópode, que são verificadas por ocasião de seu beneficiamento no curtume (GOMES, 1998; 2001). Os prejuízos indiretos são resultantes dos custos de mão-de-obra necessária para o seu controle, assim como, das demais despesas com construção e manutenção infraestutura, compra de equipamentos, aquisição de carrapaticidas, entre outros gastos (GOMES, 2001), além dos danos causados pelos resíduos deixados nos produtos de origem animal e os danos ambientais decorrentes do uso desses produtos (HORN, 1983; GOMES, 2001). Um estudo realizado no Brasil estimou que o prejuízo causado pelo R. microplus à pecuária brasileira superava dois bilhões de dólares ao ano (GRISI et al., 2002). Posteriormente, as perdas foram estimadas em mais de US$ 3.90 bilhões (Grisi et al., 2013). Estimou-se que o custo operacional efetivo (COE) do banho carrapaticida pode ter apresentado aumento real em mais de 100% em três décadas (de 1980 a 2.000) (RODRIGUES et al., 2013).
Há décadas que o controle do “carrapato do boi” com produtos químicos vem se tornando cada vez mais difícil pela seleção de populações de carrapatos resistentes às diversas gerações de acaricidas. As consequências diretas do desenvolvimento destes carrapatos decorrem na utilização mais frequente de carrapaticidas cada vez mais concentrados, agravando cada vez mais a contaminação do ambiente e dos produtos alimentícios derivados de bovinos e elevando os custos do controle e, consequentemente, da produção pecuária (NOLAN et al., 1989).
Hoje, o controle de R. microplus, principal espécie de carrapato que compromete a produtividade da pecuária bovina, ainda é um grande problema para o sistema produtivo de bovinos no Brasil, principalmente, devido ao surgimento da resistência aos diferentes princípios, limitando o sucesso do seu principal método de controle, o químico (OLIVEIRA et al., 2013).
O controle alternativo do carrapato vem sendo estimulado apesar de sua resposta ainda pouco expressiva. Os métodos são os mais variados: seleção de bovinos resistentes aos carrapatos (TEODORO et al., 2004); rotação de pastagens (ELDER et al., 1980); cultivo de pastagens que dificultam a sobrevivência das larvas (SUTHERST et al., 1982); manejo de predadores naturais, como Egretta íbis – ou garça-vaqueira (ALVES-BRANCO et al., 1983), e formigas (GONZALES, 1995); utilização de patógenos como o fungo Beauveria bassiana (CORDOVÉS, 1997) e a bactéria Cedecea lapagei (BRUM, 1988); e fitoterápicos (ANDREOTTI et al. 2013).
O controle químico é o mais amplamente utilizado no combate ao “carrapato do boi”. Os carrapaticidas podem ser aplicados por aspersão, por banho em solução aquosa, no dorso (pouron), por injeção ou por bolos gástricos (ANDREOTTI et al., 2002). Os princípios ativos mais utilizados têm sido os derivados de piretróides, ivermectinas e benzoilfeniluréia (VAZ JÚNIOR, 1997), sendo que para todos já existem registros de populações de carrapatos resistentes (OLIVEIRA et al., 2013). Os piretróides apresentam registro de resistência desde 1989 (ALVES-BRANCO et al., 1992).
A utilização de carrapaticidas de maneira extensiva e sem orientação técnica, além de elevar o custo da produção, promove a seleção de linhagens de carrapatos geneticamente resistentes, que torna mais difícil o controle do parasita, aumentando o custo do tratamento. A resistência dos carrapatos aos princípios ativos vem sendo desenvolvida de forma intensa, comprometendo a utilização de certas moléculas no manejo do controle de carrapato em determinadas regiões (ANDREOTTI et al. 2002).
No Brasil, nas áreas mais favoráveis, a população de R. microplus produz quatro gerações a cada ano, enquanto, em regiões como o Rio Grande do Sul, produz apenas três gerações. Apesar disso, ainda não existe uma política oficial de controle deste parasita, levando os produtores a adotarem práticas de controle individuais, promovendo uma prática diversificada de medidas de controle e contribuindo substancialmente para o desenvolvimento de populações de carrapatos do boi resistentes aos poucos grupos ou famílias de produtos carrapaticidas existentes (NOLAN, 1994; MARTINS et al., 1995).
As vacinas surgem neste contexto como uma ferramenta alternativa para o controle do carrapato, podendo ser utilizadas em associação com o controle químico, diminuindo o número de aplicações dos acaricidas e, dessa forma, diminuindo o custo de produção. Em meio a grande procura por formas alternativas de controle do carrapato, o controle por meio de vacinas, com a indução da resposta imune em bovinos contra os carrapatos, tem mostrado resultados promissores (ANDREOTTI et al., 2002). As principais vantagens de uma vacina recombinante em relação aos acaricidas são: a vacina não é um agente químico, tem menor custo de produção e o desenvolvimento de resistência é mais lento.
Após a constatação de que a inoculação de extratos de fêmeas adultas de R. microplus em bovinos produziu uma resposta imune mediada por anticorpos contra o tecido intestinal do carrapato (AGBEDE et al., 1986; KEMP et al., 1986), investigações subsequentes identificaram uma glicoproteína presente no intestino destes carrapatos capaz de induzir imunoproteção (WILLADSEN et al., 1988; RAND et al., 1989). Diferentes protocolos foram utilizados para isolar e purificar este antígeno protetor. Pesquisadores australianos isolaram uma glicoproteína de 89 kDa, denominada Bm86 (WILLADSEN et al., 1989), expressa em células do intestino de R. microplus (GOUGH; KEMP, 1993). O gene desta proteína foi isolado e clonado em um vetor para a subsequente expressão em Escherichia coli. Após a purificação, a proteína recombinante Bm86 foi utilizada para vacinar bovinos, o que resultou em 77% de redução no peso de ovos dos carrapatos do grupo vacinado (RAND et al., 1989). Quando expressa em sistema eucariótico (sistema baculovírus), este imunógeno proporcionou proteção de 88% (RICHARDSON et al, 1993). Porém, quando a Bm86 foi expressa em leveduras, níveis distintos de eficácia foram obtidos, não pelo fato de ser expressa em leveduras, mas sim porque foi mais explorada em testes de eficácia em vários países contra diferentes populações de R. microplus (RODRIGUEZ et al., 1994; DE LA FUENTE et al., 1998; 1999).
No Brasil, em testes com bovinos submetidos à infestação natural de R. microplus, foi demonstrado que a vacinação com Bm86, na formulação da vacina Gavac®, reduziu em torno de 47% o índice de infestação dos bovinos vacinados (RODRIGUEZ et al., 1995a). Porém, a eficácia das vacinas que já estiveram disponíveis comercialmente variou entre 51% e 91% dependendo da população de carrapatos e da condição nutricional dos bovinos utilizados nos testes, sem considerar qual foi o cálculo utilizado para esta estimativa (PARIZI et al., 2009).
Foi sugerido que a variação na eficácia observada entre diferentes regiões do mundo era devido às variações nas sequências de aminoácidos das Bm86 entre as diferentes populações de carrapatos (GARCÍA-GARCÍA et al., 2000). De fato, análises de populações de carrapatos da Argentina mostraram polimorfismos no gene homólogo ao da Bm86, que resulta em uma proteína solúvel em vez da proteína ligada à membrana, como as detectadas em carrapatos da Austrália e Cuba, o que explicaria porque os carrapatos argentinos são resistentes a vacinação com Bm86. Para superar esta resistência, uma nova vacina recombinante foi produzida a partir do gene da Bm95 – alelo ao gene da Bm86. Este novo antígeno foi eficiente para proteger bovinos contra infestações de carrapatos da Argentina e Cuba (GARCÍA-GARCÍA et al., 2000).
Variações nas sequências de aminoácidos superiores a 2,8% seriam suficientes para diminuir a eficiência da vacinação quando antígenos recombinantes são utilizados (GARCÍA-GARCÍA et al., 1999). Isolados de várias regiões do Brasil, Argentina, Uruguai, Venezuela e Colômbia foram analisadas e mostraram que os genes das proteínas Bm86 e Bm95 apresentam variações que vão de 3,4% a 6,8% e as suas sequências de aminoácidos, de 1,14% a 4,56%, respectivamente (SOSSAI et al., 2005). Um estudo de variabilidade da Bm86-CG, uma proteína homóloga a Bm86, isolada de uma cepa de Campo Grande - Mato Grosso do Sul, mostrou variações de 3,5% e 3,7% na sequência de aminoácidos quando comparada às Bm86 e Bm95, respectivamente (ANDREOTTI et al., 2008).
Além disso, os bovinos vacinados com Bm86 mostraram níveis variáveis de resistência contra espécies filogeneticamente próximas de R. microplus (DE VOS et al., 2001; FRAGOSO et al., 1998; ODONGO et al, 2007). Estes níveis de proteção refletem não só a variação entre isolados de R. microplus, mas também as relações filogenéticas.

4.2. Metodologia
Expressão da proteína recombinante: Com base em ensaios anteriores, foi escolhido um clone recombinante de GS115 para ser induzido. Uma colônia isolada desse clone selecionado será inoculada em 25 mL de meio BMGY (extrato de levedura 1%, peptona 2%, fosfato de potássio 100 mM, pH 6.0, YNB 1,34 %, biotina 4 × 10–5%, glicerol 1%) e incubada durante a noite a 30 °C, a 250 rpm. As células serão coletadas por centrifugação a 1.500 x g por 5 min e ressuspendidas em meio BMMY (extrato de levedura 1%, peptona 2%, fosfato de potássio 100 mM, pH 6.0, YNB 1,34 %, biotina 4 × 10–5%, metanol 1%) para a indução a uma DO600nm= 1,0 em frascos tipo Erlenmeyer de 1 L. O cultivo será então incubado por mais 4 dias a 30 °C, a 250 rpm. A cada 24 h, uma alíquota de 1 mL de cultivo será coletada, e a DO600nm aferida. A indução será mantida com a adição de 0,5% de metanol (v/v) a cada 24 h. Ao final de 5 dias, o cultivo será centrifugado e o sobrenadante tratado com 0,1 mM de PMSF. A proteína total do sobrenadante será precipitada com 60 % de sulfato de amônia e ultracentrifugação a 20.000 × g por 45 min., a 4 °C. A proteína será ressuspendida em Tris-HCl 100 mM, pH 7,4, e dialisada contra esta mesma solução 1:1.000 (v/v), duas vezes durante 12 h cada. Estas condições já estão optimizadas.
SDS-PAGE, Western blotting e quantificação: Serão misturados 20 µL de sobrenadante com 5 µL de tampão de amostra NuPAGE® (invitrogen). A solução será aquecida a 70 °C por 10 min. e utilizada para SDS-PAGE em condição desnaturante. Os géis de poliacrilamida serão feitos duplicatas. Um será corado com solução de nitrato de prata e o outro será submetido à transferência para uma membrana de nitrocelulose. A membrana de nitrocelulose será bloqueada com leite em pó desnatado 3%, deixada secar e cortada em tiras. Cada tira será revelada com diferentes soros primários: anti-Bm86-CG, anti-BmTI, anti-TT, anti-extrato de larvas de R. microplus e anti-6xHis tag. Estes soros já foram produzidos. A proteína recombinante será quantificada a partir do sobrenadante da cultura, em SDS-PAGE 10%, por comparação a curva de diluição de BSA (0,5-10 µg por poço), coradas com azul de coomassie. Também serão quantificadas com espectrofotômetro com filtro A280nm.
Vacinação de bovinos: Os ensaios de vacinação de bovinos serão realizados com o objetivo de se calcular a porcentagem de eficácia do antígeno recombinante contra infestações de R. microplus. Para isso, serão utilizados bovinos de raça europeia de rebanhos de 3 fazendas da região Sul do RS, 2 de região com histórico de infestação por carrapato e 1 de zona livre de carrapato, todas sob convênio de colaboração com a UFPEL. Os animais de zonas endêmicas serão acompanhados por 28 dias, procedendo-se a contagem semanal de teleóginas fixadas em cada animal. A partir dos resultados das contagens, os animais serão separados em 2 grupos randomizados pelo número de teleóginas fixadas. Um grupo será inoculado com 2 mL da formulação vacinal contendo a proteína recombinante rTI-CG-Th e outro grupo inoculado com o mesmo volume de placebo (Tris-HCl 100 mM, pH 7,4), utilizado como controle. Cada animal do grupo vacinal será injetado com 3 doses de 100 µg de proteína recombinante em formulação vacinal com 60% de Montanide ISA 61 VG (Seppic), por via intramuscular, com intervalos de 30 dias entre a primeira e a segunda dose, e de 150 dias entre a primeira e a terceira dose (dias 0, 30 e 150). Já os animais de zona livre do carrapato receberam as duas primeiras doses na propriedade e, após serem transferidos para zona endêmica, serão acompanhados clinicamente e receberão a terceira dose na fazenda de destino. Todos os animais do experimento terão seu sangue colhido a cada 30 dias para obtenção de soro. O soro será armazenado a -20 °C até a sua utilização. Os animais serão infestados naturalmente com R. microplus. No momento da contagem de teleóginas fixadas para randomização dos grupos, também serão colhidas teleóginas ingurgitadas, as quais serão incubadas a 27 °C, 80% de umidade, para realizarem postura e, caso seja preciso, as larvas emergidas dos ovos dessas teleóginas serão utilizadas para infestação dos bovinos após a segunda dose da vacina. Os efeitos da vacinação na população desse carrapato serão avaliados pela contagem, seguida de coleta de teleóginas fixadas nos animais de cada grupo. As teleoginas coletas, no máximo 10 espécimes de cada animal, serão incubadas em estufa a 27 °C, 80% de umidade, para realização de postura e avaliação do efeito vacinal no ciclo biológico, como sugerido por Cunha et al. (2013), adaptando-se a fórmula %E = 100[1– (CRTxCROxCRF) para o cálculo de porcentagem de eficácia em teste a campo, onde: %E = porcentagem de eficácia e CRT, CRO e CRF são os efeitos da vacinação no número de teleóginas fixadas, na produção de ovos e na fertilidade dos ovos, respectivamente (CUNHA et al., 2013). Os experimentos nas três localidades ocorrerão em momentos diferentes para que as atividades não se sobreponham. No primeiro ano serão vacinados os bovinos leiteiros (experimento 1), no segundo ano os terneiros confinados (experimento 2) e no terceiro ano os animais de zona livre de carrapato (experimento 3).
Perfil e cinética de produção de anticorpos: Os soros dos bovinos serão submetidos à titulação e avaliação da cinética de IgG total, IgG1 e IgG2, respectivamente. ELISA-indireto será realizado em microplacas de 96 poços com 50 ng por poço de antígeno adsorvido com tampão carbonato-bicarbonato, pH 9,6. As placas serão bloqueadas com solução de leite em pó desnatado a 2% em tampão fosfato (PBS). Para a titulação, serão utilizadas diluições seriadas dos soros de cada animal. Para a cinética da produção de anticorpos, todos os soros serão diluídos a 1:300. Os anticorpos primários de bovinos serão detectados com anticorpos secundários anti-IgG, anti-IgG1e anti-IgG2 (Bethyl, TX). Após cada solução, as placas serão lavadas com PBS-T (PBS adicionado de 0,05% de Tween 20). A revelação será feita com solução de o-Phenylenediamine dyhydrochloride (OPD) (Sigma-Aldrich, SP, Brazil) e peróxido de hidrogênio, por 15 min a 37 °C. A reação será parada com ácido sulfúrico 2 N e submetida a leitura em leitor de microplacas (Thermo Plate, EU) com filtro de 492 nm. Esta etapa já está padronizada.
Análise estatística: Todas as amostras serão avaliadas em triplicata. Dados referentes a e diferenças no ELISA serão submetidos a análise da variância e as médias serão comparadas pelo test-t de Student, com nível de significância de 5%. A investigação da associação entre o nível de anticorpos e a porcentagem de eficácia, assim como os efeitos em cada fase de vida do carrapato, será realizada por análise de correlação linear.
Aspectos éticos: O manuseio dos animais e os procedimentos experimentais serão realizados de acordo com a legislação Brasileira (LEI Nº 11.794 de 8 de outubro de 2008), seguindo as normas do Conselho Nacional de Controle e Experimentação Animal (CONCEA). Para a realização desta pesquisa, será considerada a utilização do menor número possível de animais, assim como métodos que diminuam o desconforto destes. Esse projeto já foi cadastrado na pró-reitoria de pesquisa da UFPEL (processo nº 23110.038405/2021-10) e aprovado pela comissão e ética e experimentação animal (CEEA nº: 038405/2021-10) dessa instituição.

Produzir 160 doses de vacina no primeiro ano, 160 doses no segundo ano e outras 160 doses no terceiro ano.
No primeiro ano, vacinar 160 vacas de leite de um produtor de São Lourenço do Sul, RS.
No segundo ano, vacinar 160 terneiros uma propriedade de gado de corte do Capão do Leão, RS.
No terceiro ano, vacinar 160 terneiros de zona livre do “carrapato do boi”, em Santa Vitória do Palmar, RS.
Monitorar a taxa de infestação por R. microplus nos animais vacinados e em uma amostragem dos não vacinados.
Monitorar a duração da resposta imune nos animais vacinados, por ELISA indireto.
Obter o tempo de duração da proteção vacinal nas três condições experimentais.
Obter o resultado do teste de porcentagem de eficácia da vacina nas três condições experimentais.
Registrar o pedido de patente de, pelo menos, um produto e um processo relacionados ao desenvolvimento da vacina.