Nome do Projeto
Efeitos da exposição de Diuron e Irgarol em espermatozóides de zebrafish (Danio rerio)
Ênfase
Pesquisa
Data inicial - Data final
15/03/2021 - 15/03/2025
Unidade de Origem
Coordenador Atual
Área CNPq
Ciências Agrárias
Resumo
Os biocidas são amplamente utilizados em todo o mundo com a finalidade de controlar determinada
população de organismos que levem a prejuízos ao homem ou até mesmo a natureza. O que torna
preocupante o uso de certos biocidas, tais como Irgarol ou Diuron – herbicidas – no qual são empregados
na composição de tintas antiincrustantes, se dá pelo fato de muitas vezes atingirem organismos não alvo.
Em relação aos efeitos tóxicos que os biocidas Irgarol e Diuron causam em vertebrados, poucos dados
são encontrados, mais ainda no que se refere em como os biocidas podem afetar a reprodução dos seres
vivos. Uma vez disponível no meio aquático, o Irgarol e Diuron podem ser transferidos de organismos
para organismos, levando a propagação através das cadeias tróficas. Em uma situação pior, afetando os
espermatozoides e com isso impedindo a reprodução de ocorrer, levando a não formação de adultos.
Considerando isto, o presente projeto tem como objetivo testar a hipótese de que o Irgarol e Diuron irão
afetar negativamente diversos aspectos de espermatozoides de peixes expostos a estes biocidas. Pois,
por modificarem o funcionamento das mitocôndrias e outros mecanismos de sinalização celular, levando
a maior produção de espécies reativas de oxigênio e disfunções da motilidade espermática, como
observado em invertebrados, tais dados sustentam a hipótese do potencial efeito tóxico em vertebrados.
Portanto, este trabalho tem como objetivo verificar a toxicidade em espermatozoides de peixes expostos a
Diuron e a Irgarol. Para isso, será utilizado um citometro de fluxo onde diversas variáveis serão
analisadas: Fragmentação do DNA, peroxidação lipídica, integridade e fluidez da membrana, produção de
espécies reativas de oxigênio e funcionalidade mitocondrial; também será analisada a motilidade
espermática.
Objetivo Geral
Verificar a toxicidade em espermatozoides de peixes expostos a Diuron e a Irgarol. Objetivos Específicos.
Analisar a locomoção espermática de espermatozoides de peixes expostos a Diuron e a Irgarol. Mensurar
os danos lipídicos em espermatozoides de peixes expostos a Diuron e a Irgarol.
Analisar a locomoção espermática de espermatozoides de peixes expostos a Diuron e a Irgarol. Mensurar
os danos lipídicos em espermatozoides de peixes expostos a Diuron e a Irgarol.
Justificativa
Os pesticidas são utilizados em todo mundo com o objetivo de combater espécies
3 de animais que venham a prejudicar a agricultura ou como parte da formulação dos
4 biocidas das tintas antiincrustantes. Por ser de fácil acesso, os biocidas conseguem
5 alcançar praticamente todos os ambientes, sejam eles terrestres ou aquáticos, e deste
6 modo podendo contaminar lagos, estuários, sedimentos e rios. Uma vez dispostos no
7 ecossistema, os resíduos dos biocidas podem ficar disponíveis no ambiente de dias a anos
8 (Mai et al.,2013). Com relação à contaminação ambiente aquático, as tintas
9 antiincrustantes, por apresentarem mais de um biocida em sua composição, tem se
10 demonstrado como uma das ameaças à vida aquática (Okamura et al., 2002).
11 As tintas antiincrustantes que contêm biocidas foram classificadas como metálicas
12 e não metálicas. Dentre os biocidas antiincrustantes não metálicos estão: Diuron, Irgarol
13 1051, Sea-Nine, Clorotalonil, Diclofluanida, Tiram, Busan (TCMTB), TCMS Piridina e
14 Trifenilbornano Piridina. Já os compostos metálicos (orgânicos e inorgânicos)
15 homologados para utilização são: Zinco Piritiona, Cobre Piritiona, Ziram, Maneb, Óxido
16 Cuproso, Tiocianato de Cobre e Naftenato de Cobre (Guardiola et al., 2012; Castro et al.,
17 2011). Todos os biocidas citados acima quando expostos à animais aquáticos, desde
18 invertebrados a vertebrados, resultaram em efeitos negativos, tal como mortalidade
19 (Davies et al., 1985), inibição de enzimas (Bretaud et al.,2000), embriotoxicidade (van
20 Leeuwen & Espeldoorn, 1986), alterações nos funcionamentos das bombas de. Na/K –
21 ATPase (Katranitsas et al., 2003) e alterações na osmorregulação (McIntyre et al., 2008).
22 Ainda sobre os biocidas não metálicos Diuron e Irgarol que tem como alvo plantas
23 e algas (herbicidas), é importante ressaltar que são os mais representativos biocidas de
24 reforço orgânico empregado na composição das tintas antiincrustantes. O Diuron (1-(3,4-
25 dichlorophenyl) -3,3-dimethylurea) é relativamente persiste na água pois apresenta um
26 tempo de meia-vida de 60 dias (Harino et al., 2005), representando assim riscos aos
27 organismos aquáticos de modo geral, sejam algas, peixes ou crustáceos (Fernández-Alba
28 et al., 2002; Thomas et al., 2002). Além disso, o Diuron pode ser resuspendido do
29 sedimento tornando disponível novamente no ambiente aquático (Okamura et al., 2002).
30 Enquanto o Diuron possui meia vida de aproximadamente 60 dias, o Irgarol pode residir
31 no ambiente marinho por até 10 anos (Ranke, 2002). O Irgarol (2-methylthio-4-
32 terbutylamino-6-cyclopropylamino-s-triazine) tem como principal alvo o fotosistema II
33 inibindo o transporte de elétrons pelo ligando da proteína D1 (Holt, 1993; Ranke &
34 Jastorff, 2000). A exposição de Diuron e Irgarol, separadamente, à espermatozoides de
35 Paracentrotus lividus, uma espécie de ouriço-do-mar, levou a espermatoxicidade e
36 embriotoxicidade desses animais (Manzo et al., 2005).
37 Embora se tenham estudos sobre a espermatoxicidade do Diuron e Irgarol em
38 diversos organismos invertebrados, raros dados existem sobre a toxicidade em
39 espermatozoides de peixes. Se a hipótese de Manzo (2005) estiver correta ao afirmar que
40 o Irgarol e o Diuron afetam a homeostase de cálcio, então é esperado que os
41 espermatozoides de peixes apresentem algum prejuízo na locomoção espermática
42 alterando a via de sinalização celular para a motilidade espermática (Turner, 2006).
43 Também, o Irgarol é responsável pela situação de estresse oxidativo e disfunção
44 mitocondrial (Wang et al., 2013), e como os espermatozoides de peixes possuem um
45 sistema de defesa antioxidante fraco (Valença & Guerra, 2007), tais dados suportam mais
46 ainda a hipótese de que os biocidas citados acima de fato sejam prejudiciais aos
47 espermatozoides de peixes.
3 de animais que venham a prejudicar a agricultura ou como parte da formulação dos
4 biocidas das tintas antiincrustantes. Por ser de fácil acesso, os biocidas conseguem
5 alcançar praticamente todos os ambientes, sejam eles terrestres ou aquáticos, e deste
6 modo podendo contaminar lagos, estuários, sedimentos e rios. Uma vez dispostos no
7 ecossistema, os resíduos dos biocidas podem ficar disponíveis no ambiente de dias a anos
8 (Mai et al.,2013). Com relação à contaminação ambiente aquático, as tintas
9 antiincrustantes, por apresentarem mais de um biocida em sua composição, tem se
10 demonstrado como uma das ameaças à vida aquática (Okamura et al., 2002).
11 As tintas antiincrustantes que contêm biocidas foram classificadas como metálicas
12 e não metálicas. Dentre os biocidas antiincrustantes não metálicos estão: Diuron, Irgarol
13 1051, Sea-Nine, Clorotalonil, Diclofluanida, Tiram, Busan (TCMTB), TCMS Piridina e
14 Trifenilbornano Piridina. Já os compostos metálicos (orgânicos e inorgânicos)
15 homologados para utilização são: Zinco Piritiona, Cobre Piritiona, Ziram, Maneb, Óxido
16 Cuproso, Tiocianato de Cobre e Naftenato de Cobre (Guardiola et al., 2012; Castro et al.,
17 2011). Todos os biocidas citados acima quando expostos à animais aquáticos, desde
18 invertebrados a vertebrados, resultaram em efeitos negativos, tal como mortalidade
19 (Davies et al., 1985), inibição de enzimas (Bretaud et al.,2000), embriotoxicidade (van
20 Leeuwen & Espeldoorn, 1986), alterações nos funcionamentos das bombas de. Na/K –
21 ATPase (Katranitsas et al., 2003) e alterações na osmorregulação (McIntyre et al., 2008).
22 Ainda sobre os biocidas não metálicos Diuron e Irgarol que tem como alvo plantas
23 e algas (herbicidas), é importante ressaltar que são os mais representativos biocidas de
24 reforço orgânico empregado na composição das tintas antiincrustantes. O Diuron (1-(3,4-
25 dichlorophenyl) -3,3-dimethylurea) é relativamente persiste na água pois apresenta um
26 tempo de meia-vida de 60 dias (Harino et al., 2005), representando assim riscos aos
27 organismos aquáticos de modo geral, sejam algas, peixes ou crustáceos (Fernández-Alba
28 et al., 2002; Thomas et al., 2002). Além disso, o Diuron pode ser resuspendido do
29 sedimento tornando disponível novamente no ambiente aquático (Okamura et al., 2002).
30 Enquanto o Diuron possui meia vida de aproximadamente 60 dias, o Irgarol pode residir
31 no ambiente marinho por até 10 anos (Ranke, 2002). O Irgarol (2-methylthio-4-
32 terbutylamino-6-cyclopropylamino-s-triazine) tem como principal alvo o fotosistema II
33 inibindo o transporte de elétrons pelo ligando da proteína D1 (Holt, 1993; Ranke &
34 Jastorff, 2000). A exposição de Diuron e Irgarol, separadamente, à espermatozoides de
35 Paracentrotus lividus, uma espécie de ouriço-do-mar, levou a espermatoxicidade e
36 embriotoxicidade desses animais (Manzo et al., 2005).
37 Embora se tenham estudos sobre a espermatoxicidade do Diuron e Irgarol em
38 diversos organismos invertebrados, raros dados existem sobre a toxicidade em
39 espermatozoides de peixes. Se a hipótese de Manzo (2005) estiver correta ao afirmar que
40 o Irgarol e o Diuron afetam a homeostase de cálcio, então é esperado que os
41 espermatozoides de peixes apresentem algum prejuízo na locomoção espermática
42 alterando a via de sinalização celular para a motilidade espermática (Turner, 2006).
43 Também, o Irgarol é responsável pela situação de estresse oxidativo e disfunção
44 mitocondrial (Wang et al., 2013), e como os espermatozoides de peixes possuem um
45 sistema de defesa antioxidante fraco (Valença & Guerra, 2007), tais dados suportam mais
46 ainda a hipótese de que os biocidas citados acima de fato sejam prejudiciais aos
47 espermatozoides de peixes.
Metodologia
Animais
71 Os animais serão eutanásiados seccionando o cordão espinhal, pois o uso de anestésicos
72 pode afetar os resultados da analise espermática. Este método deverá ser aprovado pelo
73 comitê de ética do uso experimental animal. As gônadas serão removidas durante a fase
74 reprodutiva de peixes machos adultos, dissecando a região abdominal. As gônadas serão
75 colocadas individualmente em tubos Epperndorf contendo 1.5 ml de solução de lavagem
76 Beltsville (Beltsville Thawing Solution) (BTS) (Varela et al., 2012) em p.H 7.4 e
77 osmolaridade de 350 mOsm e então seccionados para auxiliar na liberação de
78 espermatozoides. A motilidade espermática será avaliada determinando a taxa de
79 motilidade e o tempo de motilidade para as amostras pré-tratamento (somente sêmen
80 fresco diluído com BTS será avaliada antes do período de incubação) pela ativação do
81 espermatozoide usando agua Milli-Q. As amostras que não que possuírem um indicativo
82 de espermatozoides mortes serão excluídas.
83 Então, para cada amostra de sêmen será diluído na proporção 1:1 (v / v) sete
84 diferentes concentrações de Irgarol, Diuron e Irgarol+Diuron para cada tratamento. As
85 concentrações serão de 0 (somente o BTS, sendo o grupo controle), 0.01, 0.1, 0.5, 1, 5, e
86 10 mg/L de Irgarol, Diuron e Irgarol+Diuron. Com isso, as amostras serão incubadas a
87 20 ºC por 10 minutos. Esta temperatura foi determinada pois os peixes sobrevivem nesta
88 faixa de temperatura, entre 18 e 26 ºC (Froese & Pauly, 2014), e também porque
89 temperatura superiores a 22 ºC leva a efeitos deletérios na sobrevivência do
90 espermatozoide. Depois do período de incubação, será realizada a analise espermática
91 que irá medir a motilidade total; parâmetros da velocidade espermática; tempo de
92 motilidade; fluidez e integridade da membrana; produção de espécies reativas de
93 oxigênio; função mitocondrial; fragmentação do DNA; TBARS.
94 Analises pelo citometro de fluxo.
95 O citometro de fluxo que será utilizado é o Attune Acoustic Focusing Cytometer®
96 (Applied Biosystems). Onde os resultados serão analisados pelo software Attune
97 Cytometric v 2.1. Para a detecção das populações de células em todas as analises, as
98 células serão coradas com Hoechst 33342 e a população será detectada pelo fotodetector
99 VL1 (filtro 450/40).
100 A fluorescência verde do H2DCFDA (ROS), rhodamina 123 (funcionalidade da
101 mitocôndria), Diacetato de carboxifluoresceina (integridade da membrana plasmática)
102 serão lidos com o fotodetector BL1 (filtro 530/30), a fluorescência laranja da merocianina
103 540 (fluidez da membrana plasmática) serão lidos com o fotodetector BL2 (filtro 574/26).
104 A fluorescência vermelha do iodeto de propidio (integridade da membrana) serão
105 lidos com o fotodetector BL3 (filtro 640LP). Dez mil eventos serão analisados por
106 amostra em uma taxa de fluxo de 200 células/segundo.
107 A integridade do DNA será mensurada usando o “sperm chromatin structure
108 assay (SCSA)”. Para esta avaliação, 10 μL de sêmen será misturado com 5 μL de TNE
109 (0.01 M Tris-HCl, 0.15 M NaCl, 0.001 M EDTA, pH 7.2). Então, será adicionado 10 μL
110 de Triton (0.1% Triton X-100) (v / v) que terá 30 segundos de incubação, seguido de outra
111 incubação de 30 segundos com a adição de 5 μL de acridina de laranja (SigmaAldrich
112 Co., St. Louis, MO, USA). Esta reação será incubada por 5 minutos. Os resultados do
113 citometro de fluxo serão expressos em porcentagem do esperma com DNA fragmentado
114 (Everson et al., 1994).
115 A determinação de TBARS, será realizado de acordo com o protocolo de Oakes e
116 Van er Kraak (2003). A fluorescência será medida com emissão em 553 nm depois de
117 uma excitação a 515 nm. Resultados serão expressos como nMol de 1, 1, 3, 3-
118 tetramethoxypropano (TMP) /1.106 células.
119 Analises estatísticas
120 Para este trabalho, serão utilizados os dados descritivos (média e erro padrão da
121 média) gerados por cada variável dependente: Fragmentação do DNA, Fluidez e
122 integridade da membrana, espécies reativas de oxigênio, funcionalidade mitocondrial,
123 motilidade total do espermatozoide e peroxidação lipídica. Para todas as variáveis
124 dependentes, será feito um teste de normalidade usando o teste Shapiro-Wilks.
125 O software Statistix® 2009 será empregado para a determinação das análises.
71 Os animais serão eutanásiados seccionando o cordão espinhal, pois o uso de anestésicos
72 pode afetar os resultados da analise espermática. Este método deverá ser aprovado pelo
73 comitê de ética do uso experimental animal. As gônadas serão removidas durante a fase
74 reprodutiva de peixes machos adultos, dissecando a região abdominal. As gônadas serão
75 colocadas individualmente em tubos Epperndorf contendo 1.5 ml de solução de lavagem
76 Beltsville (Beltsville Thawing Solution) (BTS) (Varela et al., 2012) em p.H 7.4 e
77 osmolaridade de 350 mOsm e então seccionados para auxiliar na liberação de
78 espermatozoides. A motilidade espermática será avaliada determinando a taxa de
79 motilidade e o tempo de motilidade para as amostras pré-tratamento (somente sêmen
80 fresco diluído com BTS será avaliada antes do período de incubação) pela ativação do
81 espermatozoide usando agua Milli-Q. As amostras que não que possuírem um indicativo
82 de espermatozoides mortes serão excluídas.
83 Então, para cada amostra de sêmen será diluído na proporção 1:1 (v / v) sete
84 diferentes concentrações de Irgarol, Diuron e Irgarol+Diuron para cada tratamento. As
85 concentrações serão de 0 (somente o BTS, sendo o grupo controle), 0.01, 0.1, 0.5, 1, 5, e
86 10 mg/L de Irgarol, Diuron e Irgarol+Diuron. Com isso, as amostras serão incubadas a
87 20 ºC por 10 minutos. Esta temperatura foi determinada pois os peixes sobrevivem nesta
88 faixa de temperatura, entre 18 e 26 ºC (Froese & Pauly, 2014), e também porque
89 temperatura superiores a 22 ºC leva a efeitos deletérios na sobrevivência do
90 espermatozoide. Depois do período de incubação, será realizada a analise espermática
91 que irá medir a motilidade total; parâmetros da velocidade espermática; tempo de
92 motilidade; fluidez e integridade da membrana; produção de espécies reativas de
93 oxigênio; função mitocondrial; fragmentação do DNA; TBARS.
94 Analises pelo citometro de fluxo.
95 O citometro de fluxo que será utilizado é o Attune Acoustic Focusing Cytometer®
96 (Applied Biosystems). Onde os resultados serão analisados pelo software Attune
97 Cytometric v 2.1. Para a detecção das populações de células em todas as analises, as
98 células serão coradas com Hoechst 33342 e a população será detectada pelo fotodetector
99 VL1 (filtro 450/40).
100 A fluorescência verde do H2DCFDA (ROS), rhodamina 123 (funcionalidade da
101 mitocôndria), Diacetato de carboxifluoresceina (integridade da membrana plasmática)
102 serão lidos com o fotodetector BL1 (filtro 530/30), a fluorescência laranja da merocianina
103 540 (fluidez da membrana plasmática) serão lidos com o fotodetector BL2 (filtro 574/26).
104 A fluorescência vermelha do iodeto de propidio (integridade da membrana) serão
105 lidos com o fotodetector BL3 (filtro 640LP). Dez mil eventos serão analisados por
106 amostra em uma taxa de fluxo de 200 células/segundo.
107 A integridade do DNA será mensurada usando o “sperm chromatin structure
108 assay (SCSA)”. Para esta avaliação, 10 μL de sêmen será misturado com 5 μL de TNE
109 (0.01 M Tris-HCl, 0.15 M NaCl, 0.001 M EDTA, pH 7.2). Então, será adicionado 10 μL
110 de Triton (0.1% Triton X-100) (v / v) que terá 30 segundos de incubação, seguido de outra
111 incubação de 30 segundos com a adição de 5 μL de acridina de laranja (SigmaAldrich
112 Co., St. Louis, MO, USA). Esta reação será incubada por 5 minutos. Os resultados do
113 citometro de fluxo serão expressos em porcentagem do esperma com DNA fragmentado
114 (Everson et al., 1994).
115 A determinação de TBARS, será realizado de acordo com o protocolo de Oakes e
116 Van er Kraak (2003). A fluorescência será medida com emissão em 553 nm depois de
117 uma excitação a 515 nm. Resultados serão expressos como nMol de 1, 1, 3, 3-
118 tetramethoxypropano (TMP) /1.106 células.
119 Analises estatísticas
120 Para este trabalho, serão utilizados os dados descritivos (média e erro padrão da
121 média) gerados por cada variável dependente: Fragmentação do DNA, Fluidez e
122 integridade da membrana, espécies reativas de oxigênio, funcionalidade mitocondrial,
123 motilidade total do espermatozoide e peroxidação lipídica. Para todas as variáveis
124 dependentes, será feito um teste de normalidade usando o teste Shapiro-Wilks.
125 O software Statistix® 2009 será empregado para a determinação das análises.
Indicadores, Metas e Resultados
Os biocidas, por serem altamente ameaçador à vida de diversos organismos,
128 necessitam de atenção no que se refere ao seu mecanismo de ação em seres vivos não129 alvo. Alguns estudos demonstram que os biocidas possuem um grande potencial à
130 animais, entretanto não há nenhum estudo sobre os possíveis danos que podem causar aos
131 espermatozoides, especialmente de peixes. Além de elucidar como os biocidas Diuron e
132 Irgarol atuam e o que pode causar a exposição à espermatozoides de peixes, este trabalho
133 poderá alertar a comunidade cientifica do quão preocupante são os biocidas aos
134 vertebrados aquáticos, uma vez que poderá causar danos aos espermatozoides e
135 consequentemente interromper o processo reprodutivo.
136 Portanto, é de extrema importância que estudos sejam realizados para esclarecer
137 questões sobre o que os biocidas Diuron e Irgarol podem levar
128 necessitam de atenção no que se refere ao seu mecanismo de ação em seres vivos não129 alvo. Alguns estudos demonstram que os biocidas possuem um grande potencial à
130 animais, entretanto não há nenhum estudo sobre os possíveis danos que podem causar aos
131 espermatozoides, especialmente de peixes. Além de elucidar como os biocidas Diuron e
132 Irgarol atuam e o que pode causar a exposição à espermatozoides de peixes, este trabalho
133 poderá alertar a comunidade cientifica do quão preocupante são os biocidas aos
134 vertebrados aquáticos, uma vez que poderá causar danos aos espermatozoides e
135 consequentemente interromper o processo reprodutivo.
136 Portanto, é de extrema importância que estudos sejam realizados para esclarecer
137 questões sobre o que os biocidas Diuron e Irgarol podem levar
Equipe do Projeto
| Nome | CH Semanal | Data inicial | Data final |
|---|---|---|---|
| ANTONIO SERGIO VARELA JUNIOR | |||
| CARINE DAHL CORCINI | 1 | ||
| IZANI BONEL ACOSTA | |||
| LUCIARA BILHALVA CORREA | 1 |