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As micro e macroalgas marinhas estão na base da cadeia alimentar e são geradoras de macromoléculas importantes, como aminoácidos essenciais, polissacarídeos, ácidos graxos, vitaminas e antioxidantes. Assim, esses organismos despertam o interesse da comunidade científica e de diversos setores econômicos (RAJKUMAR et al., 2014; GRIFFITHS et al., 2016; SUDHAKAR et al., 2019), devido sua vasta gama de aplicações e produtos derivados, bem como seu potencial como biorremediadores dos ambientes nos quais eles se encontram, tanto para compostos inorgânicos como orgânicos (ZERAATKAR et al., 2016; PICCINI et al., 2019). Assim, estes organismos são importantes biomonitores de metais tóxicos e outros contaminantes por apresentarem certa tolerância a grandes concentrações desses elementos e serem capazes de acumulá-los ao longo do tempo (GRESSLER et al., 2011).
Neste contexto, as micro e macroalgas vêm sendo amplamente estudadas devido à sua capacidade biorremediadora (VIDOTTI & ROLLENBERG, 2004). No entanto, é necessário conhecer o comportamento particular, as características do sistema aquático e da interação contaminante-alga para avaliar a eficácia do seu uso como ferramenta na recuperação do ecossistema. Para realizar o acompanhamento adequado da distribuição e acúmulo de contaminantes no ambiente, é necessário empregar métodos analíticos para determinação elementar total e de espécies que forneçam resultados confiáveis e que sejam possíveis de serem utilizados em procedimentos de rotina, e sem gerar grandes quantidades de resíduos. Esses métodos devem ser desenvolvidos levando em consideração os diferentes tipos de contaminantes que devem ser determinados (metais, metaloides, não metais e suas espécies), bem como as características das micro e macroalgas.
Dentre as técnicas analíticas que podem ser citadas para a determinação dos elementos mencionados, destacam-se a espectrometria de emissão óptica com plasma indutivamente acoplado (ICP-OES), a espectrometria de massa com plasma indutivamente acoplado (ICP-MS), a espectrometria de absorção atômica (AAS) com diferentes modos de atomização, bem como técnicas cromatográficas, como a cromatografia de íons com detecção condutimétrica (IC-CD) e potenciométricas como a potenciometria com eletrodo íon seletivo (ISE). Além disso, o acoplamento de técnicas analíticas, como a cromatografia de íons com detecção condutimétrica acoplada à espectrometria de massa (IC-CD-MS), também é uma alternativa para a determinação de metais e não metais e suas espécies.
Todavia, deve-se levar em consideração que estas técnicas necessitam que a amostra esteja na forma de uma solução contendo os analitos para ser analisada. Assim, é requerida a etapa de preparo de amostras, que tem por finalidade realizar a conversão das amostras sólidas e disponibilizar os analitos em uma solução. É válido ressaltar que, geralmente, essa é a etapa da sequência analítica considerada como a mais crítica, na qual se gasta a maior parte do tempo e de recursos, e na qual se comentem mais erros – que podem e devem ser minimizados através das otimizações adequadas (KRUG & ROCHA, 2016).
Dentre os principais métodos de preparo de amostra empregados para posterior determinação elementar em amostras majoritariamente orgânicas, como as algas, estão aqueles baseados na digestão da matriz por via úmida. Entretanto, esses organismos são compostos por diversas substâncias distintas e que possuem níveis de complexidade diferentes, sendo necessário avaliar em cada caso a utilização de métodos mais agressivos ou mais brandos para proporcionar a adequada decomposição da matriz (FLORES et al., 2010).
Além disso, os métodos mais clássicos de digestão por via úmida utilizam fontes de energia convencionais (como o aquecimento por convecção em chapas aquecedoras ou blocos digestores) e sistemas abertos. Esses dois fatores representam, via de regra, uma menor frequência analítica e maiores riscos de contaminação ou de perda de analitos, quando comparados ao uso de fontes de energia alternativas (como micro-ondas, ultrassom e ultravioleta) e de sistemas fechados.
Também deve-se ter em mente que, geralmente, a digestão por via úmida é realizada utilizando ácidos minerais oxidantes concentrados para promover a decomposição da matéria orgânica. Porém, o uso desses reagentes está atrelado a uma série de limitações importantes, dentre as quais pode-se citar: i) o aumento nos valores dos brancos analíticos para alguns analitos, impossibilitando a determinação em baixas concentrações; e ii) o fato de que estes reagentes não são adequados para a estabilização de todos os elementos químicos, à medida que alguns deles, principalmente alguns não metais, podem ser convertidos às suas espécies voláteis em meio ácido de solução (MELLO et al., 2012; 2013; FLORES, 2014; KRUG, ROCHA, 2016; MESKO et al., 2016). Nesse sentido, é sempre fundamental a busca por alternativas que melhor se adequem à finalidade do método em desenvolvimento.
Como alternativa a estas limitações decorrentes do uso de sistemas convencionais de aquecimento e de ácidos minerais concentrados, destacam-se métodos que empregam a radiação micro-ondas em sistemas fechados como a digestão por via úmida assistida por micro-ondas pressurizada com oxigênio (MW-O2) e a digestão por via úmida assistida por micro-ondas e radiação ultravioleta (MW-UV). Em ambos os métodos, há um agente que auxilia, de forma distinta, na eficiência de decomposição da amostra, sendo possível então a utilização de reagentes ácidos diluídos, contribuindo para a diminuição dos valores dos brancos e da geração de resíduos (FLORIAN & KNAPP, 2001; BIZZI et al., 2010; 2011a; 2011b), sendo bastante adequados e eficientes para a decomposição de diversas matrizes visando a posterior determinação – principalmente – de metais e metaloides.
Por outro lado, essas alternativas nem sempre são adequadas quando se trata da posterior determinação de analitos que volatilizam em meio ácido. Nesse sentido, uma alternativa amplamente proposta na literatura e que vem sendo amplamente adotada é a combustão iniciada por micro-ondas (MIC). Esse método de preparo de amostras proporciona a completa decomposição da matéria orgânica através de uma reação de combustão, volatilizando os analitos dentro do sistema reacional fechado e proporcionando que estes analitos sejam recolhidos e estabilizados em uma solução adequada, como soluções alcalinas diluídas ou até mesmo água ultrapura, em alguns casos (MELLO et al., 2013; (FLORES, 2014).
Além de superar as limitações mencionadas, geralmente as soluções obtidas após a utilização de métodos de preparo empregando, principalmente, a radiação micro-ondas, são compatíveis com múltiplas técnicas de determinação, incluindo aquelas de elevada sensibilidade, proporcionando a realização da quantificação dos analitos a nível traço e, em alguns casos, ultra traço (FLORES, 2014). Portanto, os métodos de preparo de amostras assistidos pela radiação micro-ondas são alternativas promissoras no que se refere a monitorização dos processos de bioacumulação e biorremediação elementar realizado por micro e macroalgas, tanto no que diz respeito à eficiência, à versatilidade e à consonância com os princípios da química analítica verde. Assim, esses métodos são adequados para análises de rotina de interesse ambiental, gerando uma grande contribuição para a sociedade.
Por outro lado, além da determinação da concentração total, a especiação de não metais em algas marinhas, tanto utilizadas como biomonitores quanto como alimentos, é de extrema importância, pois pode contribuir para a identificação de contaminações por atividades antropogênicas no ambiente marinho, bem como para garantir a segurança alimentar e a qualidade dos alimentos, respectivamente. Contudo, esse tipo de análise é considerada um desafio para a química analítica pois a integridade das espécies deve ser mantida durante todas as etapas previamente às análises (CORNELIS et al., 2005; MELLO et al., 2016).
O desafio analítico voltado para a especiação de não metais inicia relacionado ao fato de que a decomposição da amostra, através do uso de elevadas temperaturas e/ou reagentes oxidantes/redutores, pode resultar na interconversão, ou até mesmo na degradação das espécies químicas, inviabilizando a análise de especiação química (TEMPLETON et al., 2000). Geralmente, diferentes espécies de um mesmo elemento apresentam propriedades físico-químicas distintas, apresentando comportamentos diferentes dependendo das condições utilizadas. Nesse sentido, métodos de extração são os mais utilizados para esta finalidade (REZENDE et al., 2015). Porém, os efeitos de matriz são as principais interferências nesse tipo de análise, pois a matriz da amostra não é eliminada e, assim, uma otimização criteriosa das variáveis durante a avaliação do método de preparo é essencial para o sucesso da análise (TEMPLETON et al., 2000). A avaliação de métodos de extração que empregam radiação micro-ondas ou energia ultrassom podem ser alternativas para o preparo de amostras visando a posterior análise de especiação química (MELLO et al., 2016). Assim, estudos de especiação de não metais vão ao encontro da necessidade de informações quanto à presença, a concentração e as espécies de não metais em algas marinhas, podendo levar a informações que irão auxiliar no rastreamento de moléculas potencialmente nocivas à saúde, bem como possíveis contaminações dos ambientes em que esses organismos se desenvolvem.
Deste modo, o presente projeto visa a avaliação da capacidade de biorremediação de micro e macroalgas, e o desenvolvimento de métodos de preparo de amostras para a determinação de metais, metaloides e não metais, bem como suas espécies, assim como outros contaminantes em algas utilizadas nos processos de biorremediação e de biomonitorização de poluição ambiental.

Primeiramente, será realizada ampla revisão na literatura e um levantamento acerca das técnicas analíticas disponíveis para a determinação elementar e especiação química, adequadas para cada tipo de analito a ser determinado, e quais métodos de preparo de amostras de micro e macroalgas fornecem uma compatibilidade adequada das soluções com essas técnicas. Após esta etapa, serão revisados métodos de preparo de amostras possíveis de serem utilizados para a posterior determinação dos analitos em algas, buscando conhecer suas vantagens e limitações – prezando por aqueles que utilizam de fontes de energia alternativas e que apresentem adequado desempenho analítico, maior consonância com os princípios da química analítica verde, elevada frequência analítica e relativos menores custos. Também será realizada a revisão na literatura sobre a biorremediação e a possibilidade do emprego de algas nestes procedimentos.
Com relação às amostras, serão utilizadas as macroalgas coletadas em diferentes anos, através do Programa Antártico Brasileiro (PROANTAR), de pontos estratégicos da Antártica para a avaliação da bioacumulação elementar por essas espécies, servindo como bioindicadores da região de onde foram coletadas para averiguação de possíveis contaminações e coleta de outras informações relevantes desse ambiente. Por outro lado, as culturas de microalgas serão preparadas baseadas no método do guia para testes químicos da Organização para a Cooperação e Desenvolvimento Econômico (OECD, 1984). O objetivo da cultura com base no procedimento adotado é a obtenção de culturas de microalgas isentas de bactérias para testes de biorremediação.
Todas as operações devem ser realizadas sob condições estéreis, a fim de evitar a contaminação com outras algas e bactérias. Todos os sais de nutrientes do meio de cultura serão preparados como soluções estoques concentradas e armazenadas sob refrigeração e proteção de luz. Estas soluções devem ser esterilizadas por filtração ou por autoclavagem. O meio de cultura deve ser preparado por adição da quantidade correta da solução estoque em água destilada estéril cuidando para que nenhuma contaminação ou infecção ocorra. A densidade celular (número de células por mL) será avaliada utilizando microscópio óptico com câmara de contagem e a determinação da biomassa por análise gravimétrica (WEF, 2005). Para avaliação da capacidade de biorremediação, serão adicionadas duas concentrações próximas a dose letal (DL) de compostos de interesse ambiental em cada meio de cultivo. Um sistema controle também será avaliado para comparar o crescimento das células e a produção de biomassa em relação aos dois sistemas que contém o contaminante.
Com relação à determinação da concentração total dos contaminantes, serão desenvolvidos métodos de preparo de amostras combinados com técnicas de determinação adequados para cada finalidade. Nesse sentido, diferentes métodos serão avaliados, preconizando o uso de formas alternativas de energia como micro-ondas, ultrassom e ultravioleta. Visando a escolha do método mais adequado e eficiente, serão levados em consideração fatores como as características da matriz (complexidade, composição majoritária, composição minoritária), o tipo de analitos a serem determinados (metais, metaloides ou não metais), e o tipo de análise que será realizada, além da otimização de parâmetros como massa de amostra, quantidade e concentração da solução extratora/digestora/absorvedora, e tempo, temperatura e pressão requeridos para o procedimento atingir a máxima eficiência possível.
Com relação à utilização de fontes alternativas de aquecimento, serão avaliados os métodos como, por exemplo, MW-O2, MW-UV e MIC. A execução dos experimentos será realizada em um forno de micro-ondas (Multiwave 3000®, Anton Paar, Áustria), equipado com oito frascos de quartzo com volume interno máximo de 80 mL, temperatura e pressão máximas de operação de 280 °C e 80 bar, respectivamente. Além desse sistema, para a MIC serão utilizados oito suportes de quartzo para as amostras, e para a MW-UV serão utilizadas oito lâmpadas que emitem radiação ultravioleta também constituídas de quartzo. Para fins de comparação com os métodos propostos, também serão avaliados métodos baseados em extração e dissolução com fonte de aquecimento convencional, radiação micro-ondas e ultrassom, seguindo as devidas etapas de otimização. Caso seja necessário, outros métodos de preparo de amostras podem ser avaliados ao longo da pesquisa.
Por outro lado, os métodos de preparo de amostras visando a posterior especiação química que irão ser avaliados consistem, resumidamente, no processo de extração dos analitos a partir do aquecimento convencional ou assistido por micro-ondas, ou ainda, assistido por ultrassom, nos quais serão avaliados reagentes químicos adequados para a extração das espécies de interesse, com especial cuidado para preservação de cada uma das espécies. Os parâmetros a serem avaliados nos procedimentos de extração serão: a massa de amostra, o programa de irradiação micro-ondas, o tempo de extração, a temperatura, a solução extratora, o potencial hidrogeniônico do meio, a potência e frequência das ondas ultrassônicas, além da adequabilidade com as técnicas de determinação disponíveis. Esses métodos serão devidamente otimizados para as amostras de micro e macroalgas a fim de determinar as espécies químicas de não metais presentes nas amostras utilizando técnicas cromatográficas e/ou espectrométricas.
As determinações dos elementos selecionados para a pesquisa e suas espécies serão realizadas, preferencialmente, pelas técnicas de ISE, ICP-OES, ICP-MS e IC-CD-MS. As condições operacionais variam conforme as técnicas, sendo selecionadas conforme orientação dos fabricantes, mas podendo ser otimizadas visando resultados confiáveis no que diz respeito, por exemplo, à exatidão e precisão, limites de detecção e quantificação, tempo de análise por amostra, separação dos analitos, dentre outros. Cabe destacar que para a otimização do desempenho, serão realizadas avaliações das condições experimentais da técnica de IC-CD-MS para a determinação de não metais e suas espécies, referentes ao espectrômetro de massa e à eluição cromatográfica, visto que é uma técnica emergente para tal finalidade. Serão avaliadas condições adequadas para às variáveis operacionais relacionadas à cromatografia, como composição da fase móvel, gradientes de eluição, temperatura de coluna, volume de injeção e tempo de análise visando a determinação total e a especiação dos analitos. Entretanto, a escolha da técnica de determinação a ser utilizada em cada método dependerá de critérios como sensibilidade, riscos de interferências e custos de aquisição e manutenção.
A exatidão dos métodos propostos será atestada por meio de ensaios de recuperação com adição de padrão e materiais de referência certificados (CRM). Além disso, esse parâmetro também será avaliado com a comparação entre resultados obtidos utilizando diferentes métodos de preparo de amostras e técnicas de determinação. Os dados obtidos serão analisados com base em critérios empregados exclusivamente na área de química analítica, sendo possível estabelecer parâmetros de validação.

Dentre as principais metas a serem alcançadas com a realização deste projeto, pode-se mencionar:
• Desenvolver e otimizar métodos analíticos confiáveis para determinação elementar e especiação química em micro e macroalgas, que possam ser difundidos e empregados em procedimentos de rotina e para análises de interesse ambiental, visando trazer avanços relevantes não apenas para a pesquisa científica na área da química analítica, mas também para a sociedade;
• Promover a formação de recursos humanos em nível de pós-graduação através da orientação de mestres e doutores na área de desenvolvimento de métodos analíticos para determinação elementar em micro e macroalgas junto ao Programa de Pós-Graduação em Química e do Programa de Pós-Graduação em Bioquímica e Bioprospecção da UFPel;
• Promover a formação de recursos humanos em nível de graduação por meio da orientação de discentes de iniciação científica;
• Divulgar os resultados através da submissão de artigos para revistas científicas indexadas pelo sistema Qualis/CAPES e com reconhecimento internacional, bem como através da submissão de trabalhos para congressos da área a nível local, regional, nacional ou internacional.
Como resultado dos estudos realizados, é esperado que os métodos analíticos desenvolvidos sejam amplamente utilizados para análises de interesse ambiental, sendo demonstrada sua adequabilidade, relevância e viabilidade. Ainda, espera-se demonstrar nitidamente as vantagens obtidas social, ambiental e cientificamente, ao lançar mão dos princípios da química analítica verde no desenvolvimento e aplicação dos métodos propostos. Nesse sentido, os impactos que devem ser alcançados no desenvolvimento desse projeto são diversos, superando a área da química analítica e gerando informações relevantes acerca da presença, bioacumulação e biorremediação de elementos químicos no meio ambiente. Após estas avaliações, espera-se também utilizar as algas para biorremediação de ambientes contaminados por compostos de interesse ambiental. Por fim, as atividades de pesquisa visam possibilitar a aproximação, integração, formação pessoal e científica, bem como a geração de conhecimento entre pesquisadores e discentes das universidades envolvidas no desenvolvimento das atividades descritas anteriormente.