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Alguns elementos químicos relacionam-se diretamente com o metabolismo humano e, por esse motivo, estão presentes em concentrações variadas em amostras biológicas. Assim, a determinação da concentração elementar, sejam elementos essenciais ou não essenciais, em amostras biológicas pode ser considerada uma alternativa no diagnóstico e prognóstico de diversas doenças, além de poder indicar o estado nutricional e outros hábitos (POZEBON et al., 1999; BARBOSA JUNIOR et al., 2005; PARSONS & BARBOSA JUNIOR, 2007; SAVINOV et al., 2016).
Dentre os elementos químicos, pode-se destacar alguns metais como cromo (Cr), cobalto (Co), cobre (Cu), manganês (Mn), molibdênio (Mo), níquel (Ni), vanádio (V), zinco (Zn), estanho (Sn); e não metais como bromo (Br), cloro (Cl), flúor (F), iodo (I), fósforo (P), enxofre (S) e selênio (Se). Esses elementos desempenham diversas funções metabólicas importantes; entretanto, tanto em baixas concentrações quanto em excesso podem provocar diversos distúrbios ou, em alguns casos, até mesmo levar a óbito. A respeito dos elementos não essenciais, destacam-se tálio (Tl), arsênio (As), antimônio (Sb), bismuto (Bi), mercúrio (Hg) e chumbo (Pb), os quais não devem estar presentes em quaisquer concentrações no organismo humano dependendo da espécie em que se encontra (CHATT & KATZ, 1988; CISZEWSKI et al., 1997; KLAASSEN, 2001).
A área das análises clínicas baseadas em interações metabólicas conhecidas é bastante estabelecida para fins de diagnóstico. Comumente essas análises são realizadas utilizando amostras de sangue e urina, por meio da comparação com valores de referência estabelecidos para inúmeras substâncias. Apesar de serem amplamente utilizadas, a coleta dessas amostras pode ser considerada mais invasiva para o paciente quando comparada com a coleta de cabelo, por exemplo, além de serem sensíveis no que diz respeito à estocagem, transporte e manuseio quando comparadas com outras amostras, como unha. Em contrapartida a essas desvantagens, a possibilidade de utilização de outras amostras biológicas obtidas por meio de coleta menos invasiva, como cabelo, saliva e unha tem sido cada vez mais considerada e utilizada em análises clínicas. Essas amostras têm sido utilizadas em pesquisas buscando avaliar o estado clínico, funções fisiológicas humanas e toxicologia de algumas substâncias (POZEBON et al., 1999; SEIDEL et al., 2001; BARBOSA JUNIOR et al., 2005; PARSONS & BARBOSA JUNIOR, 2007; SAVINOV et al., 2016).
A relação de elementos com o metabolismo pode ser também realizada com testes com modelos animais, testes in vivo. Essas avaliações são estabelecidas na literatura considerando ensaios farmacológicos e toxicológicos para diversas substâncias orgânicas e até mesmo alguns elementos químicos, no que diz respeito à relação entre dose administrada e efeito percebido. Porém, informações a respeito da determinação elementar nos diferentes tecidos dos animais utilizados nessas avaliações são raras e, além da relação direta da presença de elementos químicos em amostras biológicas de origem humana, podem trazer várias informações em relação ao metabolismo, estado clínico, funções fisiológicas humanas e toxicologia de algumas substâncias.
Nesse sentido, destaca-se que ainda são escassas na literatura pesquisas que abordem o desenvolvimento de métodos analíticos voltados para a determinação de elementos de interesse do ponto de vista fisiológico e toxicológico em amostras biológicas, tanto de origem humana quanto de origem animal. São diversos os desafios encontrados durante o desenvolvimento de métodos adequados para esta finalidade. Dentre eles, podem-se citar as dificuldades com relação à complexidade da matriz, disponibilidade para a análise pois geralmente encontra-se disponível em pequenas quantidades e a dificuldade na determinação de elementos em baixas concentrações.
Com relação ao método, um dos primeiros desafios é a necessidade de que as amostras estejam na forma de uma solução adequada para serem analisadas utilizando técnicas que com adequada sensibilidade para detecção e quantificação de elementos traço ou ultra traço. Como mencionado anteriormente, algumas amostras biológicas apresentam uma matriz complexa, exigindo a realização de uma etapa de preparo de amostras para disponibilizar os analitos de uma maneira quantitativa para uma solução que ainda seja livre de interferentes (MELLO et al., 2012; 2013; MESKO et al., 2016).
Com relação aos métodos de preparo de amostras para matrizes majoritariamente orgânicas, como é o caso das amostras biológicas, comumente são utilizados os métodos baseados na digestão por via úmida com aquecimentos convencional por meio da utilização de ácidos oxidantes concentrados para decomposição da matéria orgânica. Entretanto, a utilização de ácidos concentrados é um fator limitante uma vez que aumentam os valores de brancos analíticos para diversos analitos impossibilitando a determinação em baixas concentrações. Além disso, quando se trata da determinação de halogênios, essa limitação é ainda mais crítica pois alguns desses elementos podem formar suas espécies voláteis em meio ácido e não permanecerem estáveis em solução (MELLO et al., 2012; 2013; FLORES, 2014; KRUG, ROCHA, 2016; MESKO et al., 2016).
Dentre as alterativas frente a utilização de ácidos concentrados pode-se destacar a digestão por via úmida assistida por micro-ondas pressurizada com oxigênio (MW-O2) e da digestão por via úmida assistida por micro-ondas e radiação ultravioleta (MW-UV). Ambos os métodos possibilitam a utilização de soluções ácidas diluídas para decompor as amostras. A MW-O2 é baseada na utilização do oxigênio para a regeneração do ácido nítrico durante o processo de decomposição (BIZZI et al., 2010; 2011a; 2011b) e a MW-UV baseada na radiação UV como auxiliar da solução digestora na decomposição fotoquímica da matéria orgânica (FLORIAN & KNAPP, 2001). A MW-O2 e MW-UV conciliam as vantagens da decomposição por via úmida em sistema fechado somadas às vantagens do aquecimento mais eficiente utilizando a radiação micro-ondas utilizando apenas ácidos diluídos.
Outra possibilidade que deve ser mencionada como alternativa para o preparo de amostras visando a posterior determinação elementar em amostras biológicas é a utilização da combustão iniciada por micro-ondas (MIC). A MIC possibilita a elevada eficiência de decomposição e possibilita a escolha de uma solução apenas para absorver os analitos. Assim, é possível utilizar soluções ácidas diluídas para a absorção de metais ou, como preconiza a literatura, soluções alcalinas diluídas ou água para a absorção de não metais (MELLO et al., 2013). Ainda com relação à MIC, o sistema utilizado para o prepara das amostras é fechado, evitando contaminações e perda dos analitos por volatilização. Além disso, neste método, o reagente limitante da reação de combustão, geralmente, será apenas a própria matéria orgânica da matriz. Assim, a pressurização com O2 garante uma maior eficiência de decomposição, mesmo quando utilizadas elevadas massas de amostra (até 1 g), quando comparado com outros métodos de combustão em sistema fechado e dependendo da matriz (MESKO, 2008).
Os três métodos apresentados anteriormente (MW-O2, MW-UV e MIC) são alternativas promissoras para o preparo de amostras em análises de rotina, superando inconvenientes comumente verificados em métodos clássicos. Os digeridos obtidos ao final desses métodos são compatíveis com múltiplas técnicas de determinação, inclusive aquelas adequadas à determinação de elementos em nível traço (FLORES, 2014). Dentre as técnicas de determinação podem-se citar as potenciométricas, como a potenciometria com eletrodo íon-seletivo (ISE); espectrométricas com plasma indutivamente acoplado, a de emissão óptica (ICP-OES) e a de massas (ICP-MS); e cromatográficas, como a cromatografia de íons com detecção condutimétrica (IC-CD) e acoplada com a espectrometria de massas (IC-CD-MS). A compatibilidade da solução final com a técnica de determinação minimiza as interferências, tanto de matriz quanto por contaminações, e os inconvenientes durante a etapa de determinação.
Nesse sentido, ressalta-se a importância do desenvolvimento de métodos analíticos utilizando as ferramentas mencionadas, que têm potencial para promover diversos avanços no que diz respeito a um tema com a relevância que possui a determinação elementar em amostras biológicas. Com os resultados que serão buscados, esses avanços deverão ser percebidos em diversas áreas, dentre as quais pode-se mencionar química, biologia, medicina, dentre outras, reforçando o aspecto multidisciplinar deste projeto.

Inicialmente, será feita uma revisão da literatura e um levantamento das técnicas analíticas disponíveis para a determinação elementar em diversos tipos de amostras. Após esta etapa, serão revisados os métodos de preparo de amostras utilizados para aquelas de origem biológica visando a posterior determinação elementar, buscando conhecer suas possíveis aplicações, vantagens e limitações.
Posteriormente, as ações deste projeto serão divididas em dois eixos principais:
a) Amostras biológicas de coleta não invasiva de origem humana;
b) Amostras biológicas provenientes de ensaios in vivo com modelos animais.
Previamente ao início do desenvolvimento das ações deste projeto com relação a ambos os eixos supracitados, as atividades específicas propostas serão enviadas ao Comitê de Ética em Pesquisa responsável e submetidas à avaliação. Uma vez que se obtenha um parecer favorável desse órgão ao desenvolvimento deste projeto, será seguida a metodologia relatada neste tópico.
Com relação às amostras biológicas de coleta não invasiva de origem humana, serão estudados protocolos de coleta e de amostragem pertinentes, e o material será obtido mediante doações de voluntários – sendo obrigatório que os mesmos assinem o Termo de Autorização de Coleta de Material Biológico fornecido pelos membros da equipe do projeto. O número de voluntários necessários será estabelecido conforme o tipo de amostra e quantidade requerida para o adequado desenvolvimento do método. À medida que este projeto não tem por objetivo a avaliação clínica dos doadores, a participação dos mesmos é restrita ao fornecimento do material biológico. Todo procedimento descrito acima seguirá os princípios éticos que tangem o tema, os quais constam nos termos de consentimento livre e esclarecido (TCLE), e de confidencialidade. Será vetada a participação de menores de 18 anos, e demais dados dos voluntários serão adquiridos por formulários anônimos.
No que diz respeito ao estudo de amostras de cabelo humano, serão coletadas aquelas que não sofreram alteração química, como por tinturas, descolorantes, dentre outros, obtidas da região pré-vertebral da cabeça, conforme descrito na literatura. A respeito das amostras de unha, poderão ser fornecidas pelo doador ou coletadas por um membro da equipe do projeto, com auxílio de uma tesoura esterilizada. Estas amostras, posteriormente à coleta, passarão por um processo de lavagem a fim de minimizar as interferências por contaminações exógenas e serão armazenadas nas condições adequadas em recipientes de polipropileno previamente descontaminados. Com relação às amostras de saliva, serão coletados pelo doador cerca de 10 mL de amostra em frascos de polipropileno previamente descontaminados, destacando que, previamente à coleta, medidas para minimizar interferências serão tomadas como, por exemplo, a orientação para a coleta da amostra em estado de jejum, sem estar fazendo uso de produtos de higiene bucal ou cosméticos na região da boca, bem como a lavagem da cavidade bucal com água ultrapura por três vezes. As condições de armazenamento serão avaliadas conforme características de cada amostra obtida, podendo ser em temperaturas que variam de -80 ºC a 7 ºC quando na forma in natura, ou nas formas de amostra seca ou liofilizada.
Com relação às amostras biológicas provenientes de ensaios in vivo com modelos animais, o material será obtido mediante parceria com outros grupos de pesquisa que utilizam esses modelos, que ficarão responsáveis pelo protocolo de manejo dos animais, administração de substâncias, eutanásia e separação dos órgãos e tecidos. Todas as amostras mencionadas serão devidamente identificadas e mantidas em ambiente apropriado na Universidade Federal de Pelotas, Avenida Eliseu Maciel, S/N. Prédio 30, sala 212 A - Centro de Ciências Químicas, Farmacêuticas e de Alimentos, 96160-000 – Capão do Leão (RS), sob responsabilidade do Laboratório de Controle de Contaminantes em Biomateriais (LCCBio).
Considerando as características inerentes às amostras biológicas, como elevada complexidade, elevado teor de matéria orgânica e presença de inúmeros concomitantes, bem como os diferentes tipos de analitos a serem determinados, diversos métodos de preparo de amostras deverão ser avaliados. Diferentes parâmetros serão modificados a fim de atender ao objetivo de cada método proposto, tais como massa de amostra; quantidade e concentração da solução extratora/digestora/absorvedora; e tempo, temperatura e pressão requeridos.
Para a avaliação dos métodos de preparo de amostras, serão empregados sistemas de energia alternativa, como micro-ondas e ultravioleta. Além disso, para a escolha do método mais pertinente serão levados em consideração fatores como as características da matriz (quantidade disponível, estado físico, complexidade) e o tipo de analito a ser determinado. Com relação à utilização de fontes alternativas de aquecimento, serão avaliados os métodos de MW-O2, MW-UV, e MIC. A execução dos experimentos será realizada em um forno de micro-ondas (Multiwave 3000®, Anton Paar, Áustria), equipado com oito frascos de quartzo com volume interno máximo de 80 mL, temperatura e pressão máximas de operação de 280 °C e 80 bar, respectivamente. Além desse sistema, para a MIC serão utilizados oito suportes de quartzo para as amostras, e para a MW-UV serão utilizadas oito lâmpadas que emitem radiação ultravioleta também constituídas de quartzo. Para fins de comparação com os métodos propostos, também serão avaliados métodos baseados em extração e dissolução com fonte de aquecimento convencional, radiação micro-ondas e ultrassom, seguindo as devidas etapas de otimização. Caso seja necessário, outros métodos de preparo de amostras podem ser avaliados ao longo da pesquisa.
As determinações dos elementos selecionados para a pesquisa serão realizadas, preferencialmente, pelas técnicas de ISE, ICP-OES, ICP-MS e IC-CD-MS. As condições operacionais variam conforme as técnicas, sendo selecionadas conforme orientação dos fabricantes, mas podendo ser otimizadas visando resultados adequados no que diz respeito, por exemplo, à exatidão e precisão, limites de detecção e quantificação, tempo de análise por amostra, separação dos analitos, dentre outros. A escolha da técnica de determinação a ser utilizada em cada método dependerá de critérios como sensibilidade, riscos de interferências e custos de aquisição e manutenção.
A exatidão dos métodos propostos será atestada por meio de ensaios de recuperação com adição de padrão e materiais de referência certificados (CRM, do inglês Certified Reference Material). Além disso, esse parâmetro também será avaliado com a comparação entre resultados obtidos utilizando diferentes métodos de preparo de amostras e técnicas de determinação. Os dados obtidos serão analisados com base em critérios empregados exclusivamente na área de química analítica, sendo possível estabelecer parâmetros de validação.

Dentre as principais metas a serem atingidas com o desenvolvimento deste projeto, pode-se mencionar:
• Estabelecer métodos analíticos confiáveis para determinação elementar em amostras de origem biológica, que possam ser difundidos e empregados em procedimentos de rotina, visando trazer avanços relevantes não apenas para a pesquisa científica na área da química analítica, mas também para a sociedade;
• Promover a formação de recursos humanos em nível de pós-graduação pela orientação de mestres e doutores na área de desenvolvimento de métodos analíticos para determinação elementar em amostras biológicas junto ao Programa de Pós-Graduação em Química e do Programa de Pós-Graduação em Bioquímica e Bioprospecção da UFPel;
• Promover a formação de recursos humanos em nível de graduação pela orientação de alunos de iniciação científica;
• Divulgar os resultados por meio da submissão de artigos para revistas científicas indexadas pelo sistema Qualis/CAPES e com reconhecimento internacional, bem como pela submissão de trabalhos para congressos da área a nível local, regional, nacional ou internacional.
Como resultado dos estudos realizados, é esperado que sejam desenvolvidos satisfatoriamente métodos analíticos adequados e viáveis para o preparo de amostras biológicas e posterior determinação elementar. Além disso, almeja-se demonstrar que mesmo a utilização de reduzidos volumes de reagentes em baixas concentrações pode possibilitar um preparo de amostras satisfatório de amostras orgânicas, como é o caso de materiais biológicos. Espera-se ainda que os resultados obtidos no desenvolvimento deste projeto possam servir de subsídio para o estabelecimento de protocolos, avaliações de triagem clínica, estudos toxicológicos e entendimento do papel de diversos elementos químicos no metabolismo.