Nome do Projeto
Avaliação de um derivado quinolínico na díade entre a Depressão e a Doença de Alzheimer
Ênfase
Pesquisa
Data inicial - Data final
14/05/2021 - 30/08/2024
Unidade de Origem
Coordenador Atual
Área CNPq
Multidisciplinar
Resumo
Diversas evidências cientificas e clínicas tem sugerido que a Depressão Maior (DM) pode representar um fator de risco para o desenvolvimento da Doença de Alzheimer (DA), ou caracterizar um estado que precede o estabelecimento da mesma. Essa relação tem sido caracterizada principalmente pela produção exacerbada de proteína beta amiloide Aβ nos estágios iniciais e tardios da DA e DM. Entretanto, os mecanismos patofisiológicos intrínsecos na relação entre essas doenças permanecem ainda não completamente elucidados. Nesse trabalho serão hipotetizadas algumas rotas celulares e bioquímicas de convergência na díade DM e DA, com o intuito de aprofundar os conhecimentos a nível fisiológico dessa relação e assim eleger possíveis alvos farmacológicos para a sua resolução. Nesse sentido, a molécula 1-(7-Cloroquinolino-4-il)-N-(4-metoxibenzil)-5-metil-1H-1,2,3-triazol-4-carboxamida (QTC-4-MeOBnA) já demonstrou efeitos terapêuticos na DA através da interação com importantes biomarcadores, como a enzima β-secretase, glicogênio sintase quinase (GSK3β), acetilcolinesterase (AChE) e ainda potencial antioxidante, que possivelmente seriam refletidos nessa díade. Por esss razões, o objetivo do presente trabalho consiste na caracterização do efeito da QTC-4-MeOBnA em reverter o comportamento tipo-depressivo e déficit cognitivo ocasionado pela produção exacerbada de Aβ. Para atingir esses objetivos serão utilizados camundongos transgênicos com alterações no metabolismo da proteína precursora amiloide com o intuito de mimetizar as características iniciais dessa relação. Por outro lado, a injeção intracerebroventricular (icv) de Aβ será utilizada a fim de caracterizar a patologia amiloide já completamente estabelecida no cérebro de animais saudáveis. Para uma maior compreensão dos mecanismos patofisiológicos envolvidos no vínculo entre essas doenças, será avaliado a formação de Aβ e sua relação com a depleção monoaminérgica, redução da plasticidade e integridade sináptica, hiperfosforilação da proteína TAU e neurodegeneração. Corroborando com esse objetivo, os eventos de hipercortisolemia, inflamação e estresse oxidativo serão analisados como alterações em comum a essas patologias. Ao fim desse estudo, pretende-se melhor caracterizar a patofisiologia da díade DM e DA, bem como formular uma alternativa terapêutica efetiva no tratamento da mesma.

Objetivo Geral

O objetivo deste trabalho consiste na elucidação dos mecanismos intrínsecos as alterações patológicas cerebrais no estabelecimento da díade DM e DA, e a determinação da atividade terapêutica da QTC-4-MeOBnA no comportamento tipo depressivo e déficit cognitivo ocasionado pela administração de Aβ em camundongos.

Justificativa

Considerando que a depressão tem sido cada vez mais reconhecida como um fator de risco para desenvolvimento de demência, é justificável a crescente atenção relacionada ao estudo de mecanismos de ação envolvidos na farmacologia de novas moléculas com potencial terapêutico multi-alvo para o tratamento em conjunto das duas doenças. Desta maneira, uma variedade de modelos explicativos vem sendo proposta, entre elas está a cascata amiloidogênica e formação de Aβ, bem como a depleção monoaminérgica, redução da plasticidade sináptica, hiperfosforilação da proteína TAU e neurodegeneração indicando que são fatores importantes no início e progressão tanto da DM quanto da DA.
Nesse sentido, neste projeto pretende-se buscar uma nova alternativa para o tratamento de pacientes com DA que sofrem de transtornos de humor que sejam eficazes para tratar em conjunto esta díade e que apresentem menos efeitos adversos. Com isso, este estudo permitirá a melhor compreensão tanto dos mecanismos pelos quais a injeção i.c.v. do peptídeo Aβ leva ao desenvolvimento do comportamento tipo-depressivo em camundongos. Assim como a utilização de camundongos portando mutações no processamento da APP como um instrumento para avaliar as alterações iniciais que poderão dar origem a essas doenças.
Tendo em vista a experiência do nosso grupo de pesquisa em avaliar a atividade farmacológica e toxicológica de moléculas bioativas, espera-se que ao final do presente projeto seja identificada uma nova molécula promissora para auxiliar no tratamento da díade DA e DM.

O projeto é inovador e de alto impacto tecnológico pois contribuirá com o fortalecimento da ciência frente as descobertas que acercam os compostos em questão, contribuindo com a clarificação dos mecanismos de ação da molécula e melhor compreensão díade entre depressão e Alzheimer. Além disso, viabiliza desenvolvimento de fármacos mais eficazes, contribuindo não só para o bem-estar do paciente, como também para a redução dos custos de tratamento. O objetivo deste trabalho é a caracterização molecular de compostos derivados quinolínicos, a partir destas informações, abrir fronteiras para a busca de novos tratamentos para destas patologias, contribuindo com a sociedade científica e tecnológica para a inovação no ramo, através da geração de produtos e patentes que pode ser bastante relevante para o crescimento tecnológico e inovador do Brasil. A pesquisa básica é essencial para a ciência aplicada, com esse conhecimento que beneficiarão milhares de pessoas no Brasil e no resto do mundo que sofrem e que sofrerão com a doença. Além disso, espera-se contribuir com a identificação dos possíveis mecanismos de ação envolvidos com a ação dos derivados quinolínicos, aumentando a confiança nas novas moléculas.
Diante do exposto, espera-se que o conhecimento gerado possa contribuir para o desenvolvimento de artigos científicos e produtos patenteáveis e comercializáveis, contribuindo para o avanço da tecnologia e ciência no país. Portanto, espera-se contribuir na divulgação cientifica (congressos nacionais e internacionais) e com a formação de recursos humanos (alunos de graduação e de pós-graduação) que vão se dedicar ao fortalecimento da capacidade inovadora das empresas nacionais
Sob o ponto de vista da formação de recursos humanos, espera-se contribuir na qualificação destes e no aumento na capacidade de geração, difusão e de utilização de conhecimentos científicos na Instituição e na região. A publicação dos resultados obtidos em revistas internacional, com classificação Qualis A na área, é uma contribuição esperada para esta proposta.

Metodologia

1. Delineamento experimental
Com o objetivo de avaliar as alterações patológicas consequentes da patologia amiloide completamente estabelecida, serão utilizados camundongos submetidos a injeção i.c.v de peptídeo Aβ (Sigma Aldrich). Os animais irão receber uma injeção i.c.v de Aβ1-40 (400 pmol) ou solução PBS (veículo) e após 7 dias serão tratados com a QTC-4-MeOBnA (1mg/Kg, i.g) ou óleo de canola no volume de 10 mL/mg durante três dias consecutivos. Ao fim dos testes comportamentais os camundongos serão submetidos a eutanásia e as regiões cerebrais de córtex e hipocampo removidos para análises bioquímicas e moleculares.
Para isso, o peptídeo Aβ1-40 será dissolvido em PBS esterilizado (pH 7,4; 1 mg/mL) e incubado a 37 ℃ durante quatro dias para induzir a agregação. Um volume de 4 µl de Aβ1-40 (400 pmol por camundongo) será administrado por via i.c.v (Medeiros et al., 2007; Cunha et al., 2014; Guerra de Souza et al., 2018; Rosa et al., 2018).
2. Testes comportamentais
2.1 Teste do campo aberto (TCA)
O teste do campo aberto (TCA) é realizado a fim de descartar possíveis alterações na atividade locomotora dos animais nos testes comportamentais. Este teste será realizado em uma caixa (30 x 45 x 45 cm) dividida em 9 quadrantes idênticos. Cada animal será colocado individualmente no centro do aparato e observado por 5 min para registrar o número de cruzamentos com as quatro patas e o número de levantamentos com as patas posteriores (Walsh; Cummins, 1976).

2.2 Teste do nado forçado (TNF)
O teste de nado forçado (TNF) é um parâmetro comportamental bem aceito para avaliar a atividade do tipo antidepressiva (Porsolt; Le Pichon; Jalfre, 1977). Neste teste os animais serão forçados a nadar em um recipiente cilíndrico aberto (10 cm de diâmetro, 25 cm de altura) contendo 19 cm de água há uma temperatura de 25 ± 1 C°. Serão avaliados, a latência para o primeiro episódio de imobilidade durante os dois primeiros minutos e o tempo de imobilidade nos próximos quatro minutos.

2.3 Teste da suspensão da cauda (TSC)
O tempo total de duração da imobilidade será medido de acordo com o método (Porsolt; Le Pichon; Jalfre, 1977). Os camundongos serão suspensos pela cauda a 50 cm acima do chão por fita adesiva, serão avaliados, a latência para o primeiro episódio de imobilidade durante os dois primeiros minutos. Um decréscimo significativo do tempo de imobilidade será um indicador do efeito antidepressivo investigado.

2.4 Splash test
O teste consiste na vaporização de uma solução de sacarose a 10% sobre o dorso de um animal colocado individualmente em um aparato de acrílico (9 x 7 x 11cm). O splash test é um válido marcador comportamental de comportamento anedônico induzido por modelos de depressão, de modo que, após a aplicação de solução de sacarose, o tempo total de auto-limpeza são mensurados durante 5 minutos. Este teste avalia o auto-cuidado e o comportamento motivacional dos animais (Haj-mirzaian et al., 2015).

2.5 Teste de preferência por sacarose
Este teste será realizado com a exposição do animal à de solução de sacarose (4%) num volume de 40 mL durante 24 horas, sendo que não haverá privação de água e comida para a realização do teste. A preferência de sacarose é através da medida do volume das garrafas de água e de sacarose após 24 horas, usando-se a diferença para o cálculo da preferência de sacarose, que é feita através da equação abaixo:
% preferência de sacarose = consumo total de sacarose x 100 Consumo/total (H2O + sacarose) (Liu et al., 2018).

2.6 Teste do labirinto em Y
Esse teste avalia a memória operacional (working memory) e a memória espacial. O labirinto em Y consiste de uma caixa em formato de Y, com cada braço referenciado como A, B e C. Neste teste, o animal é colocado em um braço e permitido que alterne espontaneamente nas entradas nos outros braços durante 6 minutos. Todas as entradas em cada braço serão sequencialmente anotadas, assim os números totais de entradas em cada baço, bem como as sequências de alternações entre os braços, registradas. As informações são analisadas para determinar o número de entrada do braço sem repetição (ABC, BCA, ACB mas não ABA, BCC, CAA...).

2.7 Teste da esquiva passiva do tipo step-down
O comportamento de esquiva passiva é utilizado para avaliar a memória de trabalho e a capacidade de aprendizado (Sakaguchi et al., 2006). O aparelho em que os animais são colocados consiste em uma caixa (30 x 20 x 20 cm) composta por três paredes de aço e uma de acrílico, sendo o piso do aparelho uma plataforma (8,0 x 1,5 x 20 cm) na sua extremidade direita e uma grade metálica ( 22 x 20 cm) do lado esquerdo. Essa grade é composta de barras conectadas a um gerador de choque (Insight Ltda, Ribeirão Preto, SP, Brasil). No dia do treinamento, os animais são colocados na plataforma e quando descem para as barras metálicas com as quatro patas recebem um estímulo elétrico (0,5mA-2s). Exatamente 24 horas após o aprendizado, os animais são submetidos ao teste, onde é avaliado o tempo de latência de cada animal para descer a plataforma chamado de aquisição, entretanto os animais não recebem nenhum estímulo elétrico. Foi estabelecido limite de 5 minutos para a execução da tarefa no dia do teste.

2.8 Marble burying test
O teste consiste em colocar nas caixas limpas dos animais sobre a maravalha 8 bolinhas de gude separadamente (15 mm de diâmetro) equidistantes em um arranjo de 2 × 4(Broekkamp et al., 1986). Os animais devem-se ser observados em um período de exploração de 30 minutos. No final o número de bolinhas enterradas devem-se serem contadas. O número de bolinhas enterradas reflete no estado tipo ansiogênico dos animais.

2.9 Teste da Cruz Elevada
O teste da cruz elevada é um método simples para avaliar comportamentos semelhantes aos da ansiedade em roedores(Leo et al., 2014). O teste é realizado em uma plataforma elevada com quatro braços sendo dois braços abertos e dois braços fechados. O animal pode explorar livremente o labirinto por 5 min, enquanto a duração e a frequência das entradas nos braços abertos são cronometradas. A tarefa é avaliar a capacidade do animal em explorar um ambiente novo em espaços altos e abertos. Consequentemente, um estado de ansiedade é caracterizado pelo aumento do tempo em que o roedor passa nos braços fechados em comparação com os braços abertos.

2.10 Reconhecimento social
Este teste será utilizado para avaliar a memória através do reconhecimento social, baseado em Kogan et al., (2000). Inicialmente o animal é ambientado em uma caixa (40 X 50 cm2, com paredes de 50 cm de altura) por 5 minutos. Após a ambientação do animal, é adicionado a caixa, um animal juvenil (2 semanas de vida). Assim é cronometrado o tempo em que o animal em tratamento destina a interação com o juvenil durante 5 minutos. Esse procedimento é repetido após uma hora e meia, para avaliar se o animal reconhece o juvenil, através do decréscimo de interação. O uso do animal juvenil é justificado pelo intuito de evitar brigas e agressões entre os animais.

2.11 Teste da comida escondida
Este teste mede a latência dos camundongos para encontrar um biscoito de chocolate escondido em um dos cantos da gaiola. Os camundongos serão familiarizados com o biscoito de chocolate por 4 dias antes do teste. Um quarto de biscoito de chocolate (~ 1,8 g) foi colocado a cada 24 h por quatro vezes na gaiola em casa na superfície da maravalha. Os camundongos receberam comida e água ad libitum. Após 4 dias da fase de familiarização, os camundongos foram privados de água e comida 12 horas antes do teste. Inicialmente, no dia do teste um pedaço de biscoito de chocolate será escondido em um canto da gaiola, embaixo da maravalha e a latência para encontrar o cookie será cronometrada. Esse teste avalia a memoria olfativa, e no presente estudo, visa avaliar a memória frente a uma recompensa, indicando também uma avaliação indireta do comportamento de anedonia apresentado pelo animal.

3. Análises Bioquímicas
3.1 Atividade da Monoamino oxidase
A atividade da mnonoamino oxidase será avaliada através do método descrito por Krajl et al. (1965) e modificado por Matsumoto et al. (1984). Assim, o homogenato será incubado na presença ou ausência de inibidores da monoamino oxidase isoforma A (clorgilina) e isoforma B (selegilina) e avaliado o consumo de kinuramina para a formação de 4-hidroxiquinolina no fluorimetro.
Para a preparação do homogenato, o córtex cerebral e o hipocampo serão imediatamente removidos e lavados em tampão de isolamento (pH 7,4, Na2PO4 / KH2PO4 isotonizado com sacarose). As mitocôndrias do córtex cerebral e hipocampo serão obtidas por centrifugação diferencial. Resumidamente, o córtex e o hipocampo serão manualmente homogeneizados com quatro volumes (p / v) do meio de isolamento. Em seguida, o homogeneizado será centrifugado a 900g a 4 ° C durante 5 min. O sobrenadante obtido será centrifugado a 12.500g por 15 min. O sedimento de mitocôndrias será então lavado uma vez com meio de isolamento e novamente centrifugado nas mesmas condições. Finalmente, o sedimento mitocondrial será reconstituído em uma solução tampão (Na2PO4 / KH2PO4 isotonizado com KCl, pH 7,4) e armazenado em alíquotas.
3.5.2 Níveis de corticosterona
A determinação dos níveis plasmáticos de corticosterona será realizada de acordo com Zenker e Bernstein (1958). Resumidamente, alíquotas de plasma serão incubadas com clorofórmio e centrifugados por 5 min a 2500 rpm, seguido pela adição de 0,1 M NaOH e outra centrifugação. Após a adição do reagente de fluorescência (H2SO4 e etanol 50%), as amostras serão centrifugadas (5 min a 10.000 g) e incubadas à temperatura ambiente por 2 h. A intensidade de fluorescência, correspondente aos níveis plasmáticos de corticosterona, serão expressos como nanograma por mililitro

Indicadores, Metas e Resultados

⇒ Formação de recursos humanos capazes de aplicar o conhecimento na busca de moléculas bioativas dirigida para áreas de ponta de interesse científico e tecnológico,

⇒ Fortalecimento do nosso grupo de pesquisa que busca a síntese e a avaliação biológica de compostos na UFPel de interesse científico e tecnológico;

⇒Envolver estudantes de Iniciação Científica e de Pós-Graduação no desenvolvimento dos objetivos específicos do projeto, formando pessoal qualificado na área;

⇒ Publicar os resultados obtidos em revistas internacionais indexadas e apresentar comunicações em congressos nacionais e/ou internacionais até o final do projeto.

 Contribuir para o surgimento de um novo produto (patentes) ou análogos.

Equipe do Projeto

NomeCH SemanalData inicialData final
JENIFER FETTER
LUCIELLI SAVEGNAGO10
MARIANA GÁLLIO FRONZA
PALOMA TABORDA BIRMANN
PALOMA TABORDA BIRMANN

Fontes Financiadoras

Sigla / NomeValorAdministrador
CNPq / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e TecnológicoR$ 48.000,00Coordenador
CNPq / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e TecnológicoR$ 60.000,00Coordenador

Plano de Aplicação de Despesas

DescriçãoValor
339030 - Material de ConsumoR$ 108.000,00

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