Nome do Projeto
Avaliação das atividades antitumoral e antioxidante de produtos naturais em modelo pré-clínico de glioblastoma multiforme
Ênfase
Pesquisa
Data inicial - Data final
01/08/2021 - 31/08/2023
Unidade de Origem
Coordenador Atual
Área CNPq
Ciências Biológicas
Resumo
O câncer é um conjunto de doenças que apresentam um crescimento celular desordenado invadindo
tecidos e órgãos, e assim possibilitam a migração de células para outras regiões do corpo. Dentre os
diversos tipos de cânceres estão o glioblastoma, que representa cerca de 50% de todas
as neoplasias que acometem o sistema nervoso central (SNC) e a cirurgia é o único tratamento
empregado, seguido de radioterapia e quimioterapia. Os produtos naturais são reconhecidos há muito
tempo como uma importante e eficaz fonte de medicamentos. Levando em consideração a problemática
associada à terapêutica do glioblastoma, existe um crescente interesse em se estudar produtos de origem natural
que possam vir a ser considerados novas terapias farmacológicas, que tenham como principal objetivo
melhorar o prognóstico e qualidade de vida dos pacientes. Em vista disso, o estudo de compostos
naturais torna-se uma proposta interessante e promissora devido as suas ações já comprovadas em
diferentes patologias, como Alzheimer, transtornos de humor entre outros, além de apresentar ação em
diferentes tipos tumorais. Levando em conta as propriedades farmacológicas dos produtos naturais já
apresentadas e a necessidade de alternativas terapêuticas que melhorem a qualidade de vida dos
pacientes com glioblastoma, o objetivo desse trabalho será avaliar o efeito antitumoral e antioxidante dos
compostos naturais em modelo in vitro e in vivo e a citotoxicidade em linhagem primária de
astrócitos.
Objetivo Geral
Avaliar o efeito antitumoral e a ação antioxidante de compostos naturais em modelo in vitro e in vivo de glioblastoma e sua citotoxicidade em linhagem primária de astrócitos.
Justificativa
O glioblastoma representa a forma mais devastadora e comum de tumor cerebral, representando cerca de 50% de todas as neoplasias do sistema nervoso central (SNC) (Holland, 2001). Segundo a Organização Mundial da Saúde (OMS), esse tumor é classificado como glioma de grau IV, de acordo com sua malignidade e morfologia (Louis et al., 2016). É o tumor cerebral com maior incidência na população e também de maior letalidade, possuindo uma baixa capacidade de metástase, entretanto grande capacidade de infiltração através do tecido cerebral (Van Meir et al., 2010). O tratamento aplicado é considerado multimodal, onde a ressecção cirúrgica é realizada sempre que possível, seguida de radioterapia e quimioterapia (Butowski et al., 2006), conferindo aos pacientes uma sobrevida média de aproximadamente 14 meses após o diagnóstico (Van Meir et al., 2010).
Na tentativa de encontrar alternativas terapêuticas para o glioblastoma, o estudo de compostos naturais torna-se uma proposta interessante e promissora devido as suas ações neuroprotetoras já comprovadas em diferentes patologias, como Alzheimer (Gerzson et al., 2020; Newman et al., 2007), depressão (Luduvico et al., 2020; Gazal et al., 2014), mania (Gazal et al., 2015), além de apresentar atividade frente a diferentes tipos tumorais (Mann et al., 2012). Sendo assim, a presente proposta objetiva caracterizar agentes terapêuticos para glioblastoma oriundos de produtos naturais a fim de melhor a qualidade de vida dos pacientes acometidos.
Na tentativa de encontrar alternativas terapêuticas para o glioblastoma, o estudo de compostos naturais torna-se uma proposta interessante e promissora devido as suas ações neuroprotetoras já comprovadas em diferentes patologias, como Alzheimer (Gerzson et al., 2020; Newman et al., 2007), depressão (Luduvico et al., 2020; Gazal et al., 2014), mania (Gazal et al., 2015), além de apresentar atividade frente a diferentes tipos tumorais (Mann et al., 2012). Sendo assim, a presente proposta objetiva caracterizar agentes terapêuticos para glioblastoma oriundos de produtos naturais a fim de melhor a qualidade de vida dos pacientes acometidos.
Metodologia
- Cultura das linhagens de glioma: A linhagem celular de glioma de rato (C6) obtidas da American Type Culture Collection (ATCC) será cultivada em meio de cultivo DMEM suplementado com 10% de soro fetal bovino (SFB) e mantida em incubadora de células à temperatura de 37ºC (5% CO2/ 95% umidade).
- Cultura primária de astrócitos: Todos os experimentos realizados com animais seguirão as normas estabelecidas pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal (CEEA) da Universidade Federal de Pelotas. As culturas primárias de astrócitos de rato serão preparadas conforme previamente descrito (Da FROTA Jr. et al. 2009). Ratos Wistar neonatos (1-3 dias) serão eutanasiados por decapitação, o córtex será isolado e dissociado mecanicamente em tampão fosfato (pH 7,6) livre de Ca+2 e de Mg+2 (CMF). O tecido dissociado será submetido à centrifugação a 1000 rpm durante 5 minutos. Posteriormente o CMF será retirado e as células serão suspensas em meio de cultura DMEM suplementado com 10% SFB. As células serão semeadas em placas de 96 poços (5x105 células/poço) e cultivadas durante 21-28 dias em estufa a 37ºC em atmosfera umidificada 5% de CO2.
- Tratamento das linhagens:
As concentrações usadas irão variar de acordo com o produto natural testado. Para a citotoxicidade serão expostas as concentrações durante 24h, 48h, 72h e após esse período as análises serão realizadas. As células que serão expostas ao meio DMEM serão consideradas controle.
- Avaliação da atividade citotóxica dos compostos: Após atingir uma confluência de 90%, as células serão plaqueadas em placas de 96 poços e tratadas em diferentes concentrações e tempos. Para determinar o efeito do composto na viabilidade celular in vitro será realizado pelo ensaio de MTT ([3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide]) e para determinação do efeito do composto na proliferação celular in vitro será realizado o teste da sulforodamina B.
- Avaliação da sobrevida in vitro: As células serão plaqueadas e expostas ao tratamento por 48h a uma concentração ainda de IC50 (concentração inibitória máxima), após o tempo do tratamento as células serão replaqueadas em placas de 6 poços e serão incubadas por um período de aproximadamente 10 dias em condições padrões de cultivo celular. Serão realizadas trocas periódicas do meio de cultivo. Por fim as células serão fixadas com metanol e coradas com cristal violeta (1%). As colônias serão contadas usando microscópio (40x).
- Avaliação da migração e adesão celular: As células serão plaqueadas e expostas ao tratamento por 48h. Será utilizada uma concentração não citotóxica para a avaliação dos dois parâmetros. Para o ensaio de migração celular, após o tempo de exposição ao tratamento será retirado o meio e será feito um risco na monocamada da placa de cultivo, com auxílio de uma ponteira. O fechamento desse risco será monitorado por microfotografia em intervalo de tempo de 0, 6, 12 e 24h. Para análise dos dados será utilizado o software Image J e será determinada uma porcentagem de inibição. Após as 24h essas células serão replaquedas e incubadas durante 2h, posteriormente serão fixadas com formaldeído (4%) e por fim coradas com cristal violeta (0,2%). As absorbâncias serão obtidas através de leitor de microplacas em um comprimento de onda de 590 nm.
- Avaliação da morte e ciclo celular: As células serão plaqueadas e expostas ao tratamento, a uma concentração próxima ao IC50, durante 48h. Para análise do ciclo celular, as células serão incubadas com iodeto de propídeo (PI) e os dados serão analisados através do citômetro de fluxo. Para avaliar a morte celular as células serão incubadas com tampão de ligação contendo anexina e iodeto. Células apoptóticas e/ou necróticas serão quantificadas usando o citômetro de fluxo.
- Parâmetros de estresse oxidativo:
• Avaliação da concentração de proteína: Será realizado em lisado de células expostas aos tratamentos, durante 48h, através do método estabelecido por Lowry e colaboradores (1951).
• Avaliação dos níveis de espécies reativas de oxigênio (ROS): Será realizado em lisado de células expostas aos tratamentos, durante 48h, através do método descrito por Dos Santos et al. (2017).
• Avaliação do conteúdo tiólico total: Será realizado em lisado de células expostas aos diferentes tratamentos, durante 48h, conforme descrito por Aksenov & Markesbery (2001).
• Avaliação da atividade da catalase (CAT): Será realizada em lisado de células expostas aos tratamentos, durante 48h, conforme descrito por Aebi (1984);
• Avaliação da atividade da superóxido dismutase (SOD): Será realizada em lisado de células expostas aos tratamentos, durante 48h, conforme descrito por Misra & Fridovich (1972);
- Modelo pré-clínico de GBM: Serão utilizados ratos machos Wistar de 60 dias obtidos no Biotério da Universidade Federal de Pelotas, mantidos em ambiente com temperatura (20 - 24 ºC) e umidade (40 - 60%) controladas, água e alimento “ad libitum”, e ciclo claro/escuro de 12 h. Os animais serão alojados em gaiolas de manutenção do tipo padrão para rato com no máximo 5 animais por gaiola. Para o implante do tumor, linhagens de glioma C6 serão cultivadas e injetadas através de cirurgia estereotáxica no tecido estriado a uma profundidade de 6,0 mm (coordenadas relativamente à bregma: 0,5 mm posterior e 3,0 mm lateral) de ratos Wistar machos previamente anestesiados por via intraperitoneal. No período pós-operatório, os animais serão acondicionados em ambiente seco e com temperatura controlada para evitar a hipotermia resultante da anestesia; os olhos serão umidecidos com solução fisiológica tamponada, a fim de evitar ressecamento; após a recuperação da anestesia, os animais serão acondicionados em caixas limpas e transferidos para a sala de pós-operatório, onde terão acesso a água e comida "ad libitum" e serão observados diariamente até a finalização do experimento. Não serão utilizados analgésicos no pós-operatório. Ao longo desse período, animais que apresentarem sinais de sofrimento/dor excessivos serão eutanasiados. Entretanto, o implante de gliomas "per se" não induz letalidade nos animais no decorrer dos vinte dias de desenvolvimento do tumor. Cinco dias após a cirurgia de implante de glioma, os animais serão tratados por via intragástrica uma vez ao dia pelo período de 15 dias com os produtos naturais nas doses estipuladas baseadas na literatura.
- Análise histopatológica dos tumores implantados: Ao final do tratamento, os ratos serão anestesiados com isoflurano e eutanasiados por punção cardíaca; os tumores serão removidos e as características patológicas serão analisadas em cortes histológicos.
- Avaliação da toxicidade dos compostos: Amostras de sangue serão obtidas por punção cardíaca e serão utilizados kits comerciais para dosagem sérica das enzimas ALT-AST e dos níveis de creatinina e ureia. Além disso, será realizada análise patológica de tecidos renal, hepático e do sistema nervoso central.
- Análise estatística: Os resultados serão expressos como média ± erro padrão e as análises estatísticas serão realizadas através do teste t de Student ou Análise de variância (ANOVA) seguida de post hoc de Tukey. Os valores serão considerados significativos quando P<0,05.
- Cultura primária de astrócitos: Todos os experimentos realizados com animais seguirão as normas estabelecidas pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal (CEEA) da Universidade Federal de Pelotas. As culturas primárias de astrócitos de rato serão preparadas conforme previamente descrito (Da FROTA Jr. et al. 2009). Ratos Wistar neonatos (1-3 dias) serão eutanasiados por decapitação, o córtex será isolado e dissociado mecanicamente em tampão fosfato (pH 7,6) livre de Ca+2 e de Mg+2 (CMF). O tecido dissociado será submetido à centrifugação a 1000 rpm durante 5 minutos. Posteriormente o CMF será retirado e as células serão suspensas em meio de cultura DMEM suplementado com 10% SFB. As células serão semeadas em placas de 96 poços (5x105 células/poço) e cultivadas durante 21-28 dias em estufa a 37ºC em atmosfera umidificada 5% de CO2.
- Tratamento das linhagens:
As concentrações usadas irão variar de acordo com o produto natural testado. Para a citotoxicidade serão expostas as concentrações durante 24h, 48h, 72h e após esse período as análises serão realizadas. As células que serão expostas ao meio DMEM serão consideradas controle.
- Avaliação da atividade citotóxica dos compostos: Após atingir uma confluência de 90%, as células serão plaqueadas em placas de 96 poços e tratadas em diferentes concentrações e tempos. Para determinar o efeito do composto na viabilidade celular in vitro será realizado pelo ensaio de MTT ([3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide]) e para determinação do efeito do composto na proliferação celular in vitro será realizado o teste da sulforodamina B.
- Avaliação da sobrevida in vitro: As células serão plaqueadas e expostas ao tratamento por 48h a uma concentração ainda de IC50 (concentração inibitória máxima), após o tempo do tratamento as células serão replaqueadas em placas de 6 poços e serão incubadas por um período de aproximadamente 10 dias em condições padrões de cultivo celular. Serão realizadas trocas periódicas do meio de cultivo. Por fim as células serão fixadas com metanol e coradas com cristal violeta (1%). As colônias serão contadas usando microscópio (40x).
- Avaliação da migração e adesão celular: As células serão plaqueadas e expostas ao tratamento por 48h. Será utilizada uma concentração não citotóxica para a avaliação dos dois parâmetros. Para o ensaio de migração celular, após o tempo de exposição ao tratamento será retirado o meio e será feito um risco na monocamada da placa de cultivo, com auxílio de uma ponteira. O fechamento desse risco será monitorado por microfotografia em intervalo de tempo de 0, 6, 12 e 24h. Para análise dos dados será utilizado o software Image J e será determinada uma porcentagem de inibição. Após as 24h essas células serão replaquedas e incubadas durante 2h, posteriormente serão fixadas com formaldeído (4%) e por fim coradas com cristal violeta (0,2%). As absorbâncias serão obtidas através de leitor de microplacas em um comprimento de onda de 590 nm.
- Avaliação da morte e ciclo celular: As células serão plaqueadas e expostas ao tratamento, a uma concentração próxima ao IC50, durante 48h. Para análise do ciclo celular, as células serão incubadas com iodeto de propídeo (PI) e os dados serão analisados através do citômetro de fluxo. Para avaliar a morte celular as células serão incubadas com tampão de ligação contendo anexina e iodeto. Células apoptóticas e/ou necróticas serão quantificadas usando o citômetro de fluxo.
- Parâmetros de estresse oxidativo:
• Avaliação da concentração de proteína: Será realizado em lisado de células expostas aos tratamentos, durante 48h, através do método estabelecido por Lowry e colaboradores (1951).
• Avaliação dos níveis de espécies reativas de oxigênio (ROS): Será realizado em lisado de células expostas aos tratamentos, durante 48h, através do método descrito por Dos Santos et al. (2017).
• Avaliação do conteúdo tiólico total: Será realizado em lisado de células expostas aos diferentes tratamentos, durante 48h, conforme descrito por Aksenov & Markesbery (2001).
• Avaliação da atividade da catalase (CAT): Será realizada em lisado de células expostas aos tratamentos, durante 48h, conforme descrito por Aebi (1984);
• Avaliação da atividade da superóxido dismutase (SOD): Será realizada em lisado de células expostas aos tratamentos, durante 48h, conforme descrito por Misra & Fridovich (1972);
- Modelo pré-clínico de GBM: Serão utilizados ratos machos Wistar de 60 dias obtidos no Biotério da Universidade Federal de Pelotas, mantidos em ambiente com temperatura (20 - 24 ºC) e umidade (40 - 60%) controladas, água e alimento “ad libitum”, e ciclo claro/escuro de 12 h. Os animais serão alojados em gaiolas de manutenção do tipo padrão para rato com no máximo 5 animais por gaiola. Para o implante do tumor, linhagens de glioma C6 serão cultivadas e injetadas através de cirurgia estereotáxica no tecido estriado a uma profundidade de 6,0 mm (coordenadas relativamente à bregma: 0,5 mm posterior e 3,0 mm lateral) de ratos Wistar machos previamente anestesiados por via intraperitoneal. No período pós-operatório, os animais serão acondicionados em ambiente seco e com temperatura controlada para evitar a hipotermia resultante da anestesia; os olhos serão umidecidos com solução fisiológica tamponada, a fim de evitar ressecamento; após a recuperação da anestesia, os animais serão acondicionados em caixas limpas e transferidos para a sala de pós-operatório, onde terão acesso a água e comida "ad libitum" e serão observados diariamente até a finalização do experimento. Não serão utilizados analgésicos no pós-operatório. Ao longo desse período, animais que apresentarem sinais de sofrimento/dor excessivos serão eutanasiados. Entretanto, o implante de gliomas "per se" não induz letalidade nos animais no decorrer dos vinte dias de desenvolvimento do tumor. Cinco dias após a cirurgia de implante de glioma, os animais serão tratados por via intragástrica uma vez ao dia pelo período de 15 dias com os produtos naturais nas doses estipuladas baseadas na literatura.
- Análise histopatológica dos tumores implantados: Ao final do tratamento, os ratos serão anestesiados com isoflurano e eutanasiados por punção cardíaca; os tumores serão removidos e as características patológicas serão analisadas em cortes histológicos.
- Avaliação da toxicidade dos compostos: Amostras de sangue serão obtidas por punção cardíaca e serão utilizados kits comerciais para dosagem sérica das enzimas ALT-AST e dos níveis de creatinina e ureia. Além disso, será realizada análise patológica de tecidos renal, hepático e do sistema nervoso central.
- Análise estatística: Os resultados serão expressos como média ± erro padrão e as análises estatísticas serão realizadas através do teste t de Student ou Análise de variância (ANOVA) seguida de post hoc de Tukey. Os valores serão considerados significativos quando P<0,05.
Indicadores, Metas e Resultados
Espera-se que os produtos naturais possuam promissora atividade antitumoral e antioxidante in vitro e in vivo, e com isso pretende-se desenvolver terapias adjuvantes para auxiliar no tratamento do glioblastoma.
Convém ressaltar alguns pontos importantes como a contribuição para o conhecimento científico na temática da proposta, ampliação de pesquisa nessa área, com consequente geração de novos resultados que serão divulgados em congressos e artigos científicos; e formação de recursos humanos.
Convém ressaltar alguns pontos importantes como a contribuição para o conhecimento científico na temática da proposta, ampliação de pesquisa nessa área, com consequente geração de novos resultados que serão divulgados em congressos e artigos científicos; e formação de recursos humanos.
Equipe do Projeto
| Nome | CH Semanal | Data inicial | Data final |
|---|---|---|---|
| CLAITON LEONETI LENCINA | 1 | ||
| FRANCIELI DA SILVA DOS SANTOS | |||
| FRANCIELI MORO STEFANELLO | 2 | ||
| JULIANE TORCHELSEN SARAIVA | |||
| MAYARA SANDRIELLY PEREIRA SOARES | |||
| NATÁLIA PONTES BONA | |||
| ROSELIA MARIA SPANEVELLO | 1 |