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Pesquisas com produtos naturais têm sido realizadas, objetivando a detecção de moléculas promissoras contra patógenos resistentes aos antifúngicos convencionais. Dentre as plantas com esse potencial investigado, aquelas pertencentes à família Lamiaceae se destacam por sua ampla variedade de espécies com propriedades biológicas ativas. Desde 2008, os estudos com diferentes extratos de partes aéreas de orégano (Origanum vulgare), manjerona (Origanum majorana) e alecrim (Rosmarinus officinalis), como óleos essenciais, extratos aquosos e hidroalcoólicos, vêm sendo conduzidos pelos integrantes de nossa equipe, formando a linha de pesquisa com fitoterápicos com atividade antifúngica. Os trabalhos desenvolvidos até então vêm demonstrando resultados satisfatórios contra fungos do complexo Sporothrix schenckii, inclusive em S. brasiliensis resistentes ao itraconazol; além de avaliação da atividade antioxidante, composição química dos extratos, citotoxicidade em diferentes linhagens renais, toxicidade reprodutiva, bem como estudos ainda em fase de publicação sobre modelos murino de infecção experimental.
Os resultados satisfatórios incentivam o aprofundamento do estudo científico nesse ínterim, os quais merecem investigações para melhor compreensão do potencial farmacológico desses produtos naturais selecionados no controle e tratamento da
esporotricose. Ainda, observa-se a escassez de estudos pertinentes à interação específica dos produtos naturais e de suas moléculas ativas, bem como compostos sintéticos, sobre a célula fúngica, e compreender os mecanismos de atuação e que podem servir de alternativa para os casos em que o patógeno causador da esporotricose apresente resistência ao itraconazol. Além disso, estudos visando a segurança desses compostos promissores devem ser investigados, investindo em estudos de toxicidade. Lacunas relacionadas aos efeitos de produtos/moléculas promissoras contra fungos do complexo Sporothrix schenckii sensíveis e resistentes ao itraconazol, bem como sobre o hospedeiro, precisam ser sanadas e melhor compreendidas, a fim de avançar para a prospecção de um fármaco ativo no tratamento da esporotricose animal e humana.

O referido projeto se trata de uma continuação de um projeto de pesquisa já em andamento, cadastrado no módulo antigo do Cobalto. Há necessidade de renovação do projeto, pois estamos em constante busca por compostos naturais que tenham uma boa ação fungicida e fungistática contra o Sporothrix spp. dando continuidade a estudos com ensaios in vitro; avaliação do mecanismo de ação sobre a célula fúngica e grau de toxicidade celular com o objetivo de encontrar um fitofármaco com boa ação e segurança farmacológica como alternativa para casos de resistência na resposta terapêutica em animais com esporotricose, micose emergente no Brasil.
Nos próximos meses até o término do período de prorrogação vão ser avaliados novos extratos e óleos essenciais, realizando-se pesquisas bibliográficas, extrações, ensaios in vitro, avaliação de mecanismo de ação e testes de toxicidade celular. Por fim será realizada a tabulação de dados, análise de resultados, análise estatística para a elaboração de artigos científicos.

Serão utlizados isolados fúngicos do Complexo Sporothrix foram utilizados, sendo oriundos da micoteca do Centro de Pesquisa e Diagnóstico em Micologia Veterinária (Universidade Federal de Pelotas/UFPel, Pelotas, RS, Brasil). Os isolados foram provenientes de casos clínicos de humanos (n: 3), caninos (n: 7) e felinos (n: 13) com esporotricose e um isolado ambiental de solo (n: 1).
Teste de Suscetibilidade Antifúngica
A atividade antifúngica foi determinada através da técnica de microdiluição em caldo em microplacas de 96 poços, em duplicata, seguindo as diretrizes do documento M27- A3 do Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI, 2008), adaptada para o uso de fitofármacos. Subculturas fúngicas em meio Brain-Heart-Infusion (BHI/Acumedia, Lansing, Michigan, EUA) à 35 °C por 48 horas foram realizadas para ativar a fase leveduriforme de Sporothrix spp. Os óleos essenciais foram testados nas concentrações de 2.25 a 72 mg/mL. Itraconazol (Cepav Pharma Ltda., São Paulo/SP, Brasil) foi utilizado como controle positivo e testado nas concentrações de 0.03 a 16 μg/mL, conforme as diretrizes do documento. Os resultados foram expressos em concentração inibitória mínima (CIM) e concentração fungicida mínima (CFM).

Uma vez vigente a proposta, espera-se que as questões ainda não elucidadas e que dificultem a prospecção de compostos químicos presentes em produtos naturais de plantas aromáticas da família Lamiaceae e/ou compostos químicos sintéticos sejam esclarecidos, especialmente no que tange a interação bioquímica para a produção do efeito farmacológico contra os fungos do complexo Sporothrix schenckii sensíveis e resistentes ao itraconazol, além dos demais objetivos abrangentes quanto à toxicidade celular, potencial irritante e atividade antibiofilme, entre outros.
Com a investigação laboratorial dos isolados fúngicos de casos clínicos de felinos e caninos com esporotricose em uma área endêmica para a doença no Brasil – Pelotas e municípios vizinhos –, os quais são localizados na região sul do Estado do Rio Grande do Sul, espera-se que a identificação da espécie do complexo Sporothrix schenckii desses casos animais estudados seja correlacionado quanto à espécie fúngica prevalente e ocorrente, como Sporothrix brasiliensis e Sporothrix schenckii, respectivamente, bem como espera-se identificar espécies ainda não reconhecidas na região estudada, como Sporothrix globosa e Sporothrix mexicana. Essa etapa só será possível em parceria interinstitucional com o Centro de Diagnóstico e Pesquisa em Micologia Veterinária, da Faculdade de Veterinária da Universidade Federal de Pelotas (UFPEL), a qual é referência estadual em esporotricose felina e canina, e apresenta infraestrutura adequada e atuação em região endêmica com crescentes casos clínicos da doença em humanos, felinos e caninos. Essa interrelação científica, tecnológica e de recursos humanos permitirá o compartilhamento de informações pertinentes para um maior esclarecimento no controle e alternativas terapêuticas na esporotricose humana e animal, contribuindo para o avanço científico no assunto.
Com os isolados clínicos de felinos e caninos com esporotricose na região endêmica e suas respectivas identificações moleculares quanto à espécie fúngica, espera-se determinar os valores de CIM e CFM do fármaco de eleição para a doença em humanos e animais, o itraconazol, bem como detectar se há diferença na resposta farmacêutica em testes de suscetibilidade antifúngica in vitro com a equivalência dos medicamentos de itraconazol, como o de referência para uso humano, o similar para uso veterinário, e os manipulados. Espera-se que, em caso de diferença na resposta in vitro de suscetibilidade e resistência de mesmos isolados testados aos itraconazóis, a análise cromatográfica demonstre divergência no grau de pureza do princípio ativo entre os medicamentos estudados. Tal resultado demonstraria a necessidade de realização de testes de suscetibilidade in vitro pré-tratamento nos casos clínicos, a fim de assegurar não somente os critérios de suscetibilidade antifúngica, mas também a veracidade farmacológica do medicamento escolhido, uma vez que falhas terapêuticas têm sido relatadas na rotina clínica veterinária, inclusive em casos clínicos cujos proprietários atendem corretamente à administração medicamentosa sem negligências. Em relação ao itraconazol de referência no mercado mundial (Sporanox®), espera-se a classificação de isolados clínicos felinos e caninos resistentes ao itraconazol, e incluí-los nos estudos conseguintes com os compostos químicos naturais e sintéticos selecionados.
Com a seleção de compostos químicos naturais a partir da composição majoritária de extratos polares e apolares de plantas da família Lamiaceae, assim como a seleção de moléculas sintéticas a partir de estudos repurposing, espera-se detectar compostos químicos ativos prospectores para o tratamento da esporotricose, bem como determinar
interações sinérgicas entre si e/ou em associação ao itraconazol, atribuindo seus valores de CIM e CFM, bem como seus respectivos tempos de morte.
Uma vez detectados os compostos ativos contra fungos do complexo Sporothrix schenckii sensíveis e resistentes ao itraconazol, pretende-se descobrir e explicar o mecanismo de ação pelo qual justifica sua atividade anti-Sporothrix spp. Se o mecanismo de ação ocorrer a nível de parede celular, pretende-se encontrar valores de CIM das microplacas contendo sorbitol maiores que os CIM daqueles isentas desse protetor osmótico, o qual protege a parede celular fúngica da penetração do composto-ativos. Se o mecanismo de ação ocorrer a nível de membrana celular, pretende-se verificar o dano da mesma, bem como a perda de seu material intracelular, através da leitura de absorbância elevada em espectrofotômetro, uma vez que os nucleotídeos dispersos, principalmente aqueles com uracila, exibem a absorbância mais forte em comparação ao controle. Se o mecanismo de ação ocorrer a nível de complexação com o ergosterol da membrana celular fúngica, espera-se encontrar valores de CIM elevados, uma vez que esses compostos se ligarão primeiramente ao ergosterol exógeno, formando um complexo, e, dessa forma, evitarão a formação de um complexo com o ergosterol próprio da membrana celular fúngica, resultando em um aumento no valor das CIM para esses compostos químicos.
Em associação à avaliação microscópica com alto potencial de aumento – a microscopia eletrônica de varredura –, pretende-se demonstrar as alterações morfológicas ocorridas sobre as células de Sporothrix spp. sensíveis e resistentes ao itraconazol e submetidas a diferentes tratamentos com os compostos químicos selecionados, comparando-as entre si e com os controles de Sporothrix spp. não-tratados e Sporothrix spp. tratados com itraconazol. Espera-se que alterações morfológicas nas hifas, com apresentação mais fina, presença de rupturas filamentosas e desestruturação do micélio aéreo, bem como redução do número de conídios aderentes e surgimento de conídios inviáveis para multiplicação fúngica. Além disso, pretende-se demonstrar que a associação entre compostos químicos e itraconazol produza efeitos sinérgicos sobre a alteração morfológica dos Sporothrix spp., provocando desestruturação celular em maior intensidade comparada aos controles. Ainda, essa etapa permitirá esclarecer e auxiliar na ampliação de conhecimentos sobre a explicação da atividade antifúngica de diferentes produtos naturais e/ou moléculas ativas contra Sporothrix spp. e outros patógenos fúngicos de importância médica humana e médica veterinária, especialmente naqueles estudos científicos em que o mecanismo de ação ainda não tenha sido explorado.
Com os objetivos visando o entendimento quanto ao grau de toxicidade dos compostos químicos selecionados, espera-se que os mesmos apresentem baixo ou nenhum grau de citotoxicidade em linhagem celular leucocitária, apresentando número de leucócitos similar ao controle-padrão através da leitura em citômetro de fluxo. Da mesma forma, espera-se que o grau de irritabilidade em modelo alternativo com ovo embrionado seja baixo ou nulo nesses compostos com atividade anti-Sporothrix spp., revelando membrana córion-alantóide com estrutura vascular normal, ausência de hemorragia, lise e coagulação, e apresentação similar ao controle.
Além disso, com as recentes publicações da habilidade de Sporothrix spp. em produzir biofilmes, além dos gêneros já conhecidos com essa capacidade, como Candida spp., Aspergillus spp. e Cryptococcus spp., pretende-se detectar esse mecanismo de defesa contra a resposta imune e advertências ambientais nos isolados fúngicos do complexo Sporothrix schenckii oriundos de felinos e caninos com esporotricose, classificando-os em graus de produção de biofilme. Em complementação, espera-se que o uso dos
compostos químicos naturais e/ou sintéticos selecionados com atividade anti-Sporothrix spp. também apresentem potencial redutor de aderência fúngica, causando interrupção no processo normal na formação do biofilme pré-formado e até sua inibição. Pretende-se demonstrar a atividade antibiofilme desses compostos em cepas-padrões de diferentes espécies Candida spp. que serão utilizadas como controle, uma vez que sabidamente são produtoras de biofilmes.
Dessa forma, a presente proposta pretende preencher as lacunas ainda incompreendidas no que tange ao mecanismo de ação e a segurança farmacológica dos compostos químicos naturais e/ou sintéticos com atividade antifúngica contra isolados clínicos do complexo Sporothrix schenckii, a fim de detectar os compostos em potencial para a elaboração de um fármaco antifúngico no tratamento da esporotricose humana e animal.