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O glioblastoma (GB) é o astrocitoma mais agressivo do sistema nervoso central, sendo que os pacientes acometidos por esse tipo tumoral exibem prognóstico ruim com sobrevida média de 12-15 meses após o diagnóstico. Devido ao fato do arsenal terapêutico do GB ser limitado a busca por novas alternativas de tratamento torna-se extremante necessária. Considerando os efeitos farmacológicos exercidos pela A. satureioides e a falta de estudos elucidando a composição endofítica desta planta medicinal, nosso grupo de pesquisa tem trabalhado no isolamento de fungos endofíticos a partir de A. satureioides. Entre os nove microrganismos isolados, o fungo endofítico nomeado pelo código MF31b11 foi escolhido para seguir com as análises antiglioma devido sua maior incidência durante o processo de purificação, bem como, maior pureza apresentada (PEDRA et al., 2018). Neste estudo, nosso grupo analisou a atividade antitumoral de extratos brutos e purificados do fungo endofítico isolado, onde foi possível identificar a fração mais efetiva e, a partir dela, isolou-se a lactona Sch-642305, a qual reduziu significativamente a proliferação e migração celular, induziu apoptose em linhagens de GB (C6 e U138MG), exibindo efeito antiglioma seletivo (PEDRA et al., 2018). Diante dos resultados alcançados, torna-se importante esclarecer a taxonomia do fungo endofítico isolado e elucidar os efeitos farmacológicos e bioquímicos (em experimentos in vitro e in vivo de modelo de GB) da fração purificada obtida a partir do extrato de atividade mais promissora. Além disso, um melhor entendimento no mecanismo de ação da lactona isolada é essencial.

Isolamento e identificação do fungo endofítico:

Caules de aparência sadia, de A. satureioides, sem marcas e ferimentos serão coletados para o isolamento do fungo endofítico. Os ramos coletados serão identificados pela Profª. Dra. Raquel Ludke, do Departamento de Botânica da Universidade Federal de Pelotas.O fungo endofítico será isolado conforme descrito por Pedra e colaboradores (2018). A identificação será realizada mediante seqüenciamento da região conservada do rDNA. Para a identificação molecular do endófito isolado, a extração do DNA genômico se dará conforme descrito por Doyle e Doyle (1990) e a amplificação da região ITS será realizada via reação em cadeia da polimerase (PCR, do inglês Polymerase Chain Reaction) utilizando os primers universais ITS1 e ITS4. A análise das sequências amplificadas e sequenciadas será realizada através da ferramenta BLAST (NCBI).

Preparação do extrato fracionado do fungo endofítico isolado:

Para a obtenção da biomassa e extração dos compostos do metabolismo secundário, o fungo isolado a partir de A.satureioides será inoculado em 100 mL de meio líquido de batata-dextrose (BD), cultivados à temperatura de 25ºC durante 25 dias. Ao final deste período, os compostos do metabolismo secundário, liberados no meio de cultivo líquido pelo fungo endofítico serão extraídos através do uso do solvente orgânico diclorometano (DCM) e as fases orgânicas serão rotaevaporadas a pressão reduzida (Rota- evaporador MA120-Marconi). Posteriormente, a extração de fase sólida será realizada utilizando cartucho de fase reversa utilizando 50% MeOHconforme descrito por Aguiar-Galvão e colaboradores (2018).

Caracterização química:
A caracterização química do extrato fracionado do fungo endofítico isolado será realizada através de cromatografia líquida de ultra-eficiência acoplada ao espectrômetro de massas de acordo com Sobreira e colaboradores (2018).

Isolamento de Sch-642305:
O extrato fracionado será concentrado em vácuo e submetido a cromatografia em coluna em sílica gel utilizando MeOH em polaridade crescente levando ao isolamento de Sch-642305. Serão analisados os dados de ressonância magnética nucelar (RMN) e a pureza da lactona será estabelecida por cromatografia líquida de alta-eficiência (HPLC, do inglês High Performance Liquid Chromatography).

Docagem molecular e síntese de Sch-642305:

Inicialmente será realizado um screnning utilizando a ferramenta Swiss Target Prediction para estimar prováveis alvos da lactona Sch-642305. Posteriormente, a docagem molecular será realizada de acordo com Dandawat e colaboradores (2012), utilizando a ferramenta AutoDock para analisar as interações do ligante com o sítio de ligação dos prováveis alvos de Sch- 642305. Após, o protocolo de síntese da lactona será definido em parceria com o Profº Dr. Ronaldo Pilli da Universidade Estadual de Campinas (UniCamp).

Animais e aspectos éticos:

Os procedimentos experimentais envolvendo animais já foram aprovados pelo Comitê de Ética e Experimentação Animal da Universidade Federal de Pelotas (UFPel) sob os seguintes números de protocolo: 4755/2016 (Anexo A) e 31292-2018 (Anexo B). Os ratos Wistar serão fornecidos pelo Biotério Central da UFPel e serão mantidos sob condições adequadas, com temperatura constante (22 ± 1 °C), ciclo claro/escuro de 12 horas e água e comida ad libtum durante todo o período experimental.

Protocolo experimental in vitro:

A linhagem celular de glioma de rato (C6) obtida da American Type Culture Collection (ATCC) será cultivada em meio de cultivo DMEM suplementado com 10% de soro fetal bovino (SFB). Após atingir uma confluência de 90%, as células serão semeadas em placas de 24 poços em uma densidade de 1x104 células por poço e mantidas em incubadora à temperatura de 37ºC (5% CO2/ 95% umidade)

As culturas primárias de astrócitos de rato serão preparadas conforme previamente descrito (DA FROTA et al., 2009). Ratos Wistar neonatos (1-3 dias) serão eutanasiados por decapitação, o córtex será isolado e dissociado mecanicamente em tampão fosfato (pH 7,6) livre de Ca+2 e de Mg+2 (CMF). O tecido dissociado será submetido à centrifugação a 1000 rpm durante 10 minutos. Após, o CMF será retirado e as células serão suspensas em meio de cultura DMEM suplementado com 10% SFB. As células serão semeadas em placas de 24 poços (2x105 células/poço) e cultivadas durante 20 dias em estufa a 37ºC em atmosfera umidificada 5% de CO2.

Após a maturação celular dos astrócitos, 1x104 células de glioma C6 serão semeadas em placas de 24 poços. O cocultivo será mantido por 48 h em incubadora de CO2 a 37 °C. Culturas de glioma C6 e de astrócitos cultivados nas mesmas condições e isoladamente serão consideradas controle.

Tratamento in vitro:

Células de glioma C6, cultura primária de astrócitos e cocultivo serão tratados com o extrato fracionado nas concentrações de 1, 5 e 10 µg/mL por 48 e 72 h. Além disso, a linhagem de glioma será exposta por 24 h a ADO (1 µM) e cafeína (10 µM). Para avaliar o envolvimento da via adenosinérgica, a cafeína (antagonista não-seletivo de receptor P1) será adicionada ao meio de cultura 30 min antes do tratamento com ADO ou extrato fracionado por 24 h. Células expostas a 0,01% de DMSO (veículo) serão consideradas como controle. Após os tempos de tratamento serão realizadas as análises experimentais.

Para avaliar a viabilidade celular será realizado o ensaio de 3-(4,5- dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio (MTT). Após o período de tratamento (24, 48 ou 72 h), as células serão gentilmente lavadas com CMF e, em seguida, serão adicionados ao meio de cultura 50 µL do reagente MTT (0,5 mg/mL) por poço. Posteriormente, ascélulas serão incubadas por 90 minem estufa a 37 °C e em atmosfera com 5% de CO2. Após, o MTT será removido e o precipitado formado será eluído em 50 μL de DMSO. A leitura das absorbâncias serárealiza em leitor de microplacas a 492nm.

A Determinação da proteína glial fibrilar ácida (GFAP; do inglês “Glial Fibrillary Acidic Protein”)
será realizada conforme Brozzi e colaborades (2009). Resumidamente, as culturas serão lavadas com tampão fosfato-salino (PBS) e fixadas com metanol gelado. Após, as células serão incubadas a temperatura ambiente por 10 minutos com PBS TWEEN (0,2%) e então bloqueadas com PBS-SFB (10%). Posteriormente, as culturas serão marcadas com anticorpo primário monoclonal de coelho anti-GFAP e incubadas a 4°C por 24h. Em seguida, as células serão incubadas com o anticorpo secundário conjugado com Alexa Flúor® 488 durante 1 hora e marcadas com 4’,6’- diamino-2-fenilindol (DAPI) (5 μg/mL). Por fim, as células serão observadas em microscópio de fluorescência.

A hidrólise dos nucleotídeos de adenina (ATP, ADP e AMP) será avaliada pelo método do verde de malaquita segundo Chan e colaboradores (1986) e as concentrações de proteína serão mensuradas pelo método do Coomassie Blue como descrito por Bradford (1976). Já a expressão das enzimas ectonucleotidases será determinada pela técnica de PCR utilizando primers específicos para as NTPDases1-3 e 5’-nucleotidase, conforme descrito por Braganhol e colaboradores (2009).

A expressão dos receptores P1, P2X7, P2Y1 e P2Y12 serão avaliados mediante análise por transcrição reversa com PCR, utilizando primers específicos, conforme descrito por Braganhol e colaboradores (2009).


Os níveis de nucleotídeos serão analisados no sobrenandante após a incubação das culturas com ATP. As amostras serão coletadas e armazenadas a -80 °C para posterior análise. ATP, ADP, AMP, ADO, inosina e hipoxantina serão analisados por cromatografia líquida de alta eficiência HPLCde acordo com Azambuja e colaboradores (2019).

A quantificação das citocinas será avaliada no sobrenadante das culturas através do ensaio imunoenzimático (ELISA,do inglês Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) utilizando kits comerciais para IL-6 e IL-10 (R&D Systems), de acordo com as recomendações do fabricante. As concentrações das citocinas serão determinadas através de um leitor de microplacas de ELISA.

Protocolo experimental in vivo:

Após atingir 90% de confluência, um total de 1x106 células de GBM C6 serão injetadas no estriado direito (coordenadas relativas ao bregma: 0,5 mm depois, 3,0 mm lateral e 6,0 mm de profundidade) de ratos Wistar (machos, 60 dias de idade)pré-anestesiados com administração intraperitoneal (ip) de cetamina e xilazina, conforme descrito por Bona e colaboradores (2020).
Sete dias após o implante do tumor, os animais serão divididos em quatro grupos experimentais: I (controle); II (GBM); III (extrato fracionado); e IV (Sch-642305). As doses do extrato fracionado e Sch-64235 deverão ser definidas. Os tratamentos serão administrados via intracerobroventricular (icv) na cisterna magna uma vez por semana durante 3 semanas (dias 7, 14 e 21), utilizando uma bomba de infusão em ratos previamente anestesiados com cetamina e xilazina.
Após 23 dias do implante do tumor, os animais serão anestesiados com isoflurano e o sangue ou líquor serão coletados para realização das análises bioquímicas. Além disso, os cérebros serão removidos, seccionados e fixados em paraformaldeído 10% (pH 7,4) para análises patológicas ou congelados a - 80 °C para realização das análises bioquímicas.As amostras serão preparadas de acordo com as técnicas a serem realizadas.

A análise histológica e quantificação do tumor será realizada por hematoxilina e eosina (HE). Para a quantificação do tamanho do tumor, as imagens serão capturadas utilizando m microscópio acoplado a uma câmera digital e a área do tumor (mm2) será quantificada através do software ImageJ. Por fim, o volume total do tumor (mm3) será calculado multiplicando as seções de corte e somando as áreas segmentadas de acordo com Da Silveira e colaboradores (2017). Em amostras de soro e cérebro serão analisados parâmetros bioquímicos, de estresse oxidativo e purinérgicos.

Diante das propriedades farmacológicas da A. sautureioides bem como do potencial dos micorganismos endofíticos na produção de metabólitos bioativos, recentemente nosso grupo de pesquisa buscou esclarecer a composição endofítica desta planta medicinal. Entre os microrganismos isolados, o fungo nomeado como MF31b11 foi avaliado quanto ao seu efeito antiglioma devido sua maior incidência durante o processo de purificação. Os resultados foram promissores, o fungo endofítico isolado foi capaz de produzir a lactona macrocíclica Sch-642305, a qual inibiu significativamente a viabilidade, proliferação e migração de células de GB de rato (C6) e de humano (U138MG). Além disso, Sch642305 reduziu a sobrevivência clonogênica, induziu apoptose e exibiu atividade antioxidante sobre as células de GB.
Considerando que a terapia empregada para o GB permanece limitada, uma possível explicação para a resposta refratária dos pacientes ao tratamento é que a quimioterapia padrão não leva em consideração a participação do microambiente na progressão tumoral. Neste contexto, uma vez que a presença de um microambiente heterogêneo, rico em fatores de crescimento e inflamatórios é essencial para a progressão dos gliomas, torna-se altamente relevante avaliar efeito do metabolismo secundário do fungo endofítico isolado sobre o sítio tumoral.
Assim, numa tentativa de reproduzir in vitro as comunicações celulares presentes no microambiente dos gliomas, pretende-se elucidar o papel dos compostos produzidos pelo fungo endofítico de A. satureioides em modelo experimental de co-cultivo entre células de glioma e astrócitos (célula glial mais abrangente no córtex cerebral, local majoritário no surgimento do GB). Além disso, diante dos efeitos exibidos pela lactona Sch-642305, busca-se melhor entender os mecanismos envolvidos com o seu potencial antiglioma in vivo visando complementar os achados obtidos anteriormente pelo nosso grupo de pesquisa. Por fim, a síntese de Sch-642305 e seus análogos poderiam aprimorar a atividade antitumoral possibilitando a translação para futuros experimentos clínicos.