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A depressão é uma doença altamente incapacitante que traz sintomas emocionais, cognitivos e físicos, afetando mais que 330 milhões de pessoas em todo o mundo (PITSILLOU et al.,2020; BAINS, ABDIJADID, 2020). Uma parcela significativa dos pacientes não consegue atingir a remissão dos sintomas a partir da farmacoterapia atual e há, por vezes, abandono dela devido à resposta lenta ao tratamento ou, ainda, aos seus efeitos colaterais (CORDÁS E MORENO, 2008). Desta forma, diversos grupos de pesquisa têm direcionado seus esforços à busca de novas drogas antidepressivas. Alguns aspectos tradicionalmente relacionados às doenças mentais comuns podem ser observados a partir do uso de modelos animais (ABELAIRA et al., 2013) e, portanto, a utilização de animais em pesquisas tem contribuído por anos para a descoberta de alternativas terapêuticas para a depressão.
Diferentes ações farmacológicas têm sido descritas para compostos contendo o núcleo benzofurano (MA et al., 2020; ZHA et al., 2016; SHAKYA et al., 2016). Além disso, há relatos de pesquisas experimentais com compostos orgânicos contendo o núcleo benzofurano testados como alternativas terapêuticas para os transtornos depressivos (CHAND et al., 2017; DAWOOD, 2019). O núcleo benzofurano pode, inclusive, ser encontrado em alguns fármacos antidepressivos de referência no mercado (SAHLI et al., 2016; SZOKE-KOVACS et al., 2020; SELPH AND MCDONAGH, 2019). Paralelamente, o selênio é um micronutriente essencial aos mamíferos, com fundamental importância para a saúde do sistema nervoso. Em razão de maior biodisponibilidade e, geralmente, menor toxicidade, as formas orgânicas de selênio têm recebido especial atenção na pesquisa pré-clínica, e alguns compostos têm demonstrado potencial como novas moléculas antidepressivas (BODNAR et al., 2016; QIAN et al., 2019; WROBEL et al., 2016).
Neste sentido, o nosso grupo de pesquisa (LABIONEM) tem voltado a sua atenção ao estudo de uma classe de 3-organoselenil-benzofuranos (SeBZF), compostos híbridos contendo selênio e o núcleo benzofurano (GALL et al., 2020; GAY et al., 2010). A atividade antioxidante de cinco compostos desta classe (SeBZF1-5) foi demonstrada em cérebro de camundongos in vitro. Os estudos in vivo foram iniciados com o protótipo da classe (SeBZF1), um SeBZF não substituído, o qual exibiu efeitos significativos em testes preditivos de ação antidepressiva em animais de ambos os sexos e sob diferentes regimes de tratamento (agudo ou repetido), sem afetar parâmetros de toxicidade até então avaliados. Tem sido também sugerido que o sistema monominérgico está, em parte, envolvido em sua atividade do tipo antidepressiva (GALL et al., 2020).
Considerando que os benzofuranos substituídos são unidades estruturais importantes em produtos biologicamente ativos, a nossa proposta é ampliar os estudos com esta classe de compostos. Desta forma, o objetivo deste estudo é avaliar a ação do tipo antidepressiva de um 3-organoselenil-benzofurano substituído (SeBZF-S) em camundongos e investigar a possível contribuição da modulação serotoninérgica neste efeito.

Serão utilizados camundongos Swiss adultos machos provenientes do Biotério central da UFPEL.
Dois testes comportamentais preditivos para ação do tipo antidepressiva serão empregados: Teste de Suspensão pela Cauda (TSC) (Steru et al., 1985) e Teste do Nado Forçado (TNF) (Porsolt et al., 1977) , nos quais a latência para o primeiro episódio de imobilidade e o tempo total de imobilidade serão cronometrados. O TNF será utilizado apenas uma vez com o intuito de caracterizar de forma robusta a atividade do tipo antidepressiva do SeBZF-S selecionado. O TSC será preconizado para a grande maioria dos experimentos com o objetivo de reduzir o número de animais e por ser mais prático e sensível à drogas serotoninérgicas.
Quatro min antes do TSC ou FST, será realizado o teste do campo aberto (TCA), o qual acompanhará todos os sets experimentais para descartar efeitos inespecíficos. Neste, será contabilizado a atividade locomotora (crossings) e exploratória (rearings).
Cada set comportamental conterá um máximo de 6 grupos experimentais (4 a 6) para evitar grande variabilidade entre dias de experimentação; e cada um deles será, portanto, conduzido em dois dias diferentes (metade do N em cada), respeitando o mesmo horário do dia para os procedimentos.
O tempo de pré-administração e doses do composto SeBZF-S foram escolhidos com base em diversos trabalhos que empregam compostos orgânicos de selênio (Donato et al., 2013; Pinto Brod, 2016; Besckow et al., 2020; Gall et al., 2020).

1. TRIAGEM E CARACTERIZAÇÃO DA ATIVIDADE DO TIPO ANTIDEPRESSIVA DO CANDIDATO À ANTIDEPRESSIVO

1A. Triagem para detecção de atividade do tipo antidepressiva no teste de TSC: seleção do SeBZF-S com o melhor perfil antidepressivo.
Para este set experimental, os animais serão tratados com uma dose fixa de 50 mg/kg pela via oral com os SeBZF 3, 4 e 5 (SeBZF substituídos) ou seu veículo (óleo de canola). O SeBZF1 (não substituído, protótipo da classe) também na dose de 50 mg/kg (GALL et al., 2020) será empregado apenas neste experimento para fins de comparação de efetividade (e validação dos resultados). Trinta min após a administração, os animais serão avaliados no TSC. A partir deste experimento será selecionado o SeBZF substituído (SeBZF-S) mais efetivo, o qual será empregado nos demais testes.

1B. Curva dose-resposta com SeBZF-S selecionado no Teste do Nado Forçado (TNF)
Conforme preconizado pela CEEA, serão estipuladas 3 doses para a curva dose-resposta. Os animais serão tratados com o SeBZF-S nas doses de 5, 25 ou 50 mg/kg (v.o.) ou óleo de canola. A fluoxetina (20 mg/kg, v.o., dose efetiva) será utilizada como um controle positivo (antidepressivo de uso clínico; inibidor seletivo da recaptação de serotonina-ISRS) para validação do teste comportamental (ZHAO at al., 2018). Trinta min após a administração das drogas, será conduzido o TNF, o qual será empregado apenas neste set afim de caracterizar com robustez a atividade do tipo-antidepressiva do SeBZF-S.

1C. Curva dose-resposta com SeBZF-S selecionado no TSC
De forma análoga ao experimento 1B, os animais serão tratados com o SeBZF-S nas doses de 5, 25 ou 50 mg/kg (v.o.) ou óleo de canola, e a fluoxetina usada como controle positivo para a validação do experimento (ZHAO at al., 2018). Trinta min após a administração das drogas, será conduzido o TSC.

1D. Curva tempo-resposta com SeBZF-S selecionado no TSC
Uma vez fixada a dose efetiva para o SeBZF-S, serão estipulados 3 tempos de pré-administração (30, 60 e 120 min) para a confecção de uma curva tempo-resposta no TSC. Animais controles receberão óleo de canola.

Havendo necessidade de acréscimo de nova dose ou tempo nestas curvas, os animais serão solicitados via adendo ao projeto com a respectiva justificativa.

2. ESTUDO DO MECANISMO DE AÇÃO ENVOLVIDO NO EFEITO DO TIPO ANTIDEPRESSIVO DO SEBZF-S: SISTEMA SEROTONINÉRGICO

2A. Investigação do envolvimento do receptor 5-HT1A no efeito do tipo antidepressivo do SeBZF-S: uso de WAY 100635
Para a investigação do envolvimento do receptor serotoninérgico 5-HT1A no efeito do tipo antidepressivo do SeBZF-S, os camundongos serão pré-tratados com WAY100635 (0,1 mg/kg, s.c., antagonista seletivo do receptor 5-HT1A) ou salina. Após um período de 15 minutos da administração do antagonista, os animais serão tratados com o SeBZF-S (em uma dose efetiva) ou óleo de canola e então serão submetidos ao TSC.
2B. Investigação do envolvimento do receptor 5-HT2A/2C no efeito do tipo antidepressivo do SeBZF-S: uso de quetanserina
Os camundongos serão pré-tratados com quetanserina (1 mg/kg, i.p., antagonista não seletivo de receptores 5-HT2A/2C) ou salina. Após um período de 15 minutos da administração do antagonista, os animais serão tratados com o SeBZF-S (v.o.) ou óleo de canola em uma dose efetiva e submetidos ao TSC.
2C. Investigação do envolvimento do receptor 5-HT3 no efeito do tipo antidepressivo do SeBZF-S: uso de ondansetrona
Os camundongos serão pré-tratados com ondansetrona (1 mg/kg, i.p., antagonista não seletivo de receptores 5-HT3) ou salina. Após um período de 15 minutos da administração do antagonista, os animais serão tratados com o SeBZF-S (v.o.) ou óleo de canola em uma dose efetiva e submetidos ao TSC.
2D. Investigação do possível efeito sinergístico com um ISRS via uso de fluoxetina
Nós também investigaremos a possível interação entre administrações orais de doses subefetivas do SeBZF-S selecionado (a ser determinada) e fluoxetina (5 mg/kg) (Gall et al. 2020). Para esta proposta, os animais receberão fluoxetina ou salina, e após 10 min receberão o SeBZF-S, ambos em doses que não produzem efeito por si só. O possível efeito sinergístico será avaliado após 30 min da administração do SeBZF-S no TSC.

3. ESTUDO DE TOXICIDADE ORAL AGUDA
Para avaliar a possível toxicidade do SeBZF-S selecionado, os camundongos receberão uma única dose oral do composto selecionado na dose de 300 mg/kg (dose sugerida pela OECD) ou veículo (óleo de canola ). Serão utilizados camundongos com jejum de 3-4h antes da administração e com variação de no máximo 20% do peso corporal. Os animais serão observados a cada 30 min durante as primeiras 24h e depois diariamente por 14 dias (OECD) para determinar o potencial letal dos compostos. Peso corporal, consumo hídrico e alimentar, locomoção e aspecto do animal serão avaliados. Conforme indicado no protocolo o experimento avaliará inicialmente 3 animais por grupo num primeiro momento, e posteriormente repetido, resultando em um N de 6 animais/grupo.
Após este tempo de exposição, os camundongos serão anestesiados com isoflurano para o procedimento de punção cardíaca e o sangue será coletado em tubos contendo heparina. O plasma será obtido após centrifugação e usado para ensaios bioquímicos através de kits comerciais. As atividades das enzimas aspartato aminotransferase (AST) e alanina aminotransferase (ALT) no plasma serão usadas como indicadores de função hepática. A função renal será avaliada pela dosagem dos níveis plasmáticos de uréia.
OECD/OCDE 423. Adopted: 17th December 2001. OECD GUIDELINE FOR TESTING OF CHEMICALS. Acute Oral Toxicity – Acute Toxic Class Method

4. ESTUDO DE DOCKING MOLECULAR
Com o intuito de reforçar os achados comportamentais, a técnica de docagem molecular será realizada para predizer a possível interação do composto com os receptores serotoninérgicos. Trata-se de estudos computacionais e, portanto, não envolve o uso de animais. Docking molecular ou ancoragem molecular é uma ferramenta chave para predizer a melhor orientação de ajuste de um ligante em uma proteína. Essa abordagem nos permite caracterizar o comportamento de pequenas moléculas no sítio de ligação das proteínas alvo, assim como, elucidar as interações moleculares.

Espera-se identificar uma molécula com potencialidade para o desenvolvimento de uma nova terapia voltada ao tratamento de transtornos psiquiátricos, tais como a depressão. Além disso, almeja-se que ela possua baixo risco de gerar efeitos adversos, e espera-se contribuir na elucidação de seus mecanismos de ação através do emprego de pesquisa pré-clínica. Por fim, espera-se contribuir na formação de recursos humanos no PPGBBio e envolver alunos de iniciação científica. Anseia-se pela geração de resumos, artigos científicos e possível patente.