Nome do Projeto
Avaliação pré-clínica de um 3-organoselenil-benzofurano substituído como um agente terapêutico para a depressão
Ênfase
Pesquisa
Data inicial - Data final
02/08/2021 - 02/08/2024
Unidade de Origem
Coordenador Atual
Área CNPq
Ciências Biológicas
Resumo
A depressão caracteriza-se por ser uma doença psiquiátrica crônica e multifatorial relacionada, em parte, a alterações no sistema monoaminérgico. Os compostos contendo o núcleo benzofurano e/ou selênio tem se mostrado moléculas em potencial para desempenhar ações centrais. O objetivo deste estudo é avaliar a ação do tipo antidepressiva de um 3-organoselenil-benzofurano (SeBZF) substituído (SeBZF-S) em camundongos bem como investigar a possível contribuição da modulação serotoninérgica nesta atividade farmacológica. Para este fim, o estudo será dividido em diferentes sets de experimentos comportamentais. Inicialmente, será realizada uma triagem para a constatação de uma possível ação do tipo antidepressiva dos compostos SeBZF substituídos (SeBZF 2-5) (50 mg/kg; via oral, v.o.; 30 min) no teste de suspensão pela cauda (TSC), um teste com valor preditivo e amplamente empregado para a triagem de drogas antidepressivas e seus mecanismos de ação. O SeBZF1, protótipo desta classe não substituído e previamente estudado por nosso grupo, será empregado para fins comparativos apenas no experimento de triagem. Dentre os SeBZF 2-5 substituídos, será selecionado aquele com ação do tipo antidepressiva mais pronunciada para os experimentos sequenciais. Então, uma curva dose-resposta (5, 25 e 50 mg/kg) do SeBZF substituído escolhido será conduzida em dois testes de valor preditivo (TSC e teste do nado forçado, TNF) para uma caracterização mais acurada de sua ação farmacológica. Uma vez caracterizada a ação o tipo-antidepressiva em ambos os testes, apenas o TSC será empregado para o restante deste projeto. A seguir, será realizada uma curva tempo-resposta (0,5; 1 e 2h) com o intuito de averiguar a duração do efeito antidepressivo do composto. Fluoxetina em uma dose efetiva (20 mg/kg, v.o.) será utilizada como um controle positivo de medicação antidepressiva. Uma vez que a dose e tempo de pré-administração estejam definidos, será investigado o envolvimento do sistema serotoninérgico no efeito do tipo-antidepressivo do SeBZF substituído escolhido através do uso de antagonistas deste sistema, uma ferramenta farmacológica bastante utilizada neste campo de estudo. Para esta proposta, os camundongos serão pré-tratados com WAY100635 (antagonista seletivo do receptor 5-HT1A), quetanserina (antagonista não seletivo de receptores 5-HT2A/2C), ondansetrona (antagonista seletivo do receptor 5-HT3) ou salina e, então, receberão uma dose efetiva do SeBZF substituído ou óleo de canola. A seguir, os animais serão submetidos ao TSC. Paralelamente, o possível efeito sinergístico da coadministração de doses subefetivas do SeBZF-S e fluoxetina (um antidepressivo padrão que age via inibição da recaptação de serotonina) também será averiguado. O teste do campo aberto acompanhará todos os sets de experimentos para descartar efeitos inespecíficos sobre a locomoção. Será ainda avaliada a possível toxicidade de uma alta dose do SeBZF substituído selecionado conforme indicado pela OECD, experimento no qual parâmetros como peso corporal, consumo hídrico e alimentar e marcadores bioquímicos de dano hepático e renal serão acessados. Para fortalecer as hipóteses mecanísticas de ação antidepressiva, docagem molecular também será empregada neste projeto.

Objetivo Geral

Avaliar a ação do tipo antidepressiva de um 3-organoselenil-benzofurano substituído (SeBZF-S) em camundongos.

Justificativa

A depressão é uma doença altamente incapacitante que traz sintomas emocionais, cognitivos e físicos, afetando mais que 330 milhões de pessoas em todo o mundo (PITSILLOU et al.,2020; BAINS, ABDIJADID, 2020). Uma parcela significativa dos pacientes não consegue atingir a remissão dos sintomas a partir da farmacoterapia atual e há, por vezes, abandono dela devido à resposta lenta ao tratamento ou, ainda, aos seus efeitos colaterais (CORDÁS E MORENO, 2008). Desta forma, diversos grupos de pesquisa têm direcionado seus esforços à busca de novas drogas antidepressivas. Alguns aspectos tradicionalmente relacionados às doenças mentais comuns podem ser observados a partir do uso de modelos animais (ABELAIRA et al., 2013) e, portanto, a utilização de animais em pesquisas tem contribuído por anos para a descoberta de alternativas terapêuticas para a depressão.
Diferentes ações farmacológicas têm sido descritas para compostos contendo o núcleo benzofurano (MA et al., 2020; ZHA et al., 2016; SHAKYA et al., 2016). Além disso, há relatos de pesquisas experimentais com compostos orgânicos contendo o núcleo benzofurano testados como alternativas terapêuticas para os transtornos depressivos (CHAND et al., 2017; DAWOOD, 2019). O núcleo benzofurano pode, inclusive, ser encontrado em alguns fármacos antidepressivos de referência no mercado (SAHLI et al., 2016; SZOKE-KOVACS et al., 2020; SELPH AND MCDONAGH, 2019). Paralelamente, o selênio é um micronutriente essencial aos mamíferos, com fundamental importância para a saúde do sistema nervoso. Em razão de maior biodisponibilidade e, geralmente, menor toxicidade, as formas orgânicas de selênio têm recebido especial atenção na pesquisa pré-clínica, e alguns compostos têm demonstrado potencial como novas moléculas antidepressivas (BODNAR et al., 2016; QIAN et al., 2019; WROBEL et al., 2016).
Neste sentido, o nosso grupo de pesquisa (LABIONEM) tem voltado a sua atenção ao estudo de uma classe de 3-organoselenil-benzofuranos (SeBZF), compostos híbridos contendo selênio e o núcleo benzofurano (GALL et al., 2020; GAY et al., 2010). A atividade antioxidante de cinco compostos desta classe (SeBZF1-5) foi demonstrada em cérebro de camundongos in vitro. Os estudos in vivo foram iniciados com o protótipo da classe (SeBZF1), um SeBZF não substituído, o qual exibiu efeitos significativos em testes preditivos de ação antidepressiva em animais de ambos os sexos e sob diferentes regimes de tratamento (agudo ou repetido), sem afetar parâmetros de toxicidade até então avaliados. Tem sido também sugerido que o sistema monominérgico está, em parte, envolvido em sua atividade do tipo antidepressiva (GALL et al., 2020).
Considerando que os benzofuranos substituídos são unidades estruturais importantes em produtos biologicamente ativos, a nossa proposta é ampliar os estudos com esta classe de compostos. Desta forma, o objetivo deste estudo é avaliar a ação do tipo antidepressiva de um 3-organoselenil-benzofurano substituído (SeBZF-S) em camundongos e investigar a possível contribuição da modulação serotoninérgica neste efeito.

Metodologia

Serão utilizados camundongos Swiss adultos machos provenientes do Biotério central da UFPEL.
Dois testes comportamentais preditivos para ação do tipo antidepressiva serão empregados: Teste de Suspensão pela Cauda (TSC) (Steru et al., 1985) e Teste do Nado Forçado (TNF) (Porsolt et al., 1977) , nos quais a latência para o primeiro episódio de imobilidade e o tempo total de imobilidade serão cronometrados. O TNF será utilizado apenas uma vez com o intuito de caracterizar de forma robusta a atividade do tipo antidepressiva do SeBZF-S selecionado. O TSC será preconizado para a grande maioria dos experimentos com o objetivo de reduzir o número de animais e por ser mais prático e sensível à drogas serotoninérgicas.
Quatro min antes do TSC ou FST, será realizado o teste do campo aberto (TCA), o qual acompanhará todos os sets experimentais para descartar efeitos inespecíficos. Neste, será contabilizado a atividade locomotora (crossings) e exploratória (rearings).
Cada set comportamental conterá um máximo de 6 grupos experimentais (4 a 6) para evitar grande variabilidade entre dias de experimentação; e cada um deles será, portanto, conduzido em dois dias diferentes (metade do N em cada), respeitando o mesmo horário do dia para os procedimentos.
O tempo de pré-administração e doses do composto SeBZF-S foram escolhidos com base em diversos trabalhos que empregam compostos orgânicos de selênio (Donato et al., 2013; Pinto Brod, 2016; Besckow et al., 2020; Gall et al., 2020).

1. TRIAGEM E CARACTERIZAÇÃO DA ATIVIDADE DO TIPO ANTIDEPRESSIVA DO CANDIDATO À ANTIDEPRESSIVO

1A. Triagem para detecção de atividade do tipo antidepressiva no teste de TSC: seleção do SeBZF-S com o melhor perfil antidepressivo.
Para este set experimental, os animais serão tratados com uma dose fixa de 50 mg/kg pela via oral com os SeBZF 3, 4 e 5 (SeBZF substituídos) ou seu veículo (óleo de canola). O SeBZF1 (não substituído, protótipo da classe) também na dose de 50 mg/kg (GALL et al., 2020) será empregado apenas neste experimento para fins de comparação de efetividade (e validação dos resultados). Trinta min após a administração, os animais serão avaliados no TSC. A partir deste experimento será selecionado o SeBZF substituído (SeBZF-S) mais efetivo, o qual será empregado nos demais testes.

1B. Curva dose-resposta com SeBZF-S selecionado no Teste do Nado Forçado (TNF)
Conforme preconizado pela CEEA, serão estipuladas 3 doses para a curva dose-resposta. Os animais serão tratados com o SeBZF-S nas doses de 5, 25 ou 50 mg/kg (v.o.) ou óleo de canola. A fluoxetina (20 mg/kg, v.o., dose efetiva) será utilizada como um controle positivo (antidepressivo de uso clínico; inibidor seletivo da recaptação de serotonina-ISRS) para validação do teste comportamental (ZHAO at al., 2018). Trinta min após a administração das drogas, será conduzido o TNF, o qual será empregado apenas neste set afim de caracterizar com robustez a atividade do tipo-antidepressiva do SeBZF-S.

1C. Curva dose-resposta com SeBZF-S selecionado no TSC
De forma análoga ao experimento 1B, os animais serão tratados com o SeBZF-S nas doses de 5, 25 ou 50 mg/kg (v.o.) ou óleo de canola, e a fluoxetina usada como controle positivo para a validação do experimento (ZHAO at al., 2018). Trinta min após a administração das drogas, será conduzido o TSC.

1D. Curva tempo-resposta com SeBZF-S selecionado no TSC
Uma vez fixada a dose efetiva para o SeBZF-S, serão estipulados 3 tempos de pré-administração (30, 60 e 120 min) para a confecção de uma curva tempo-resposta no TSC. Animais controles receberão óleo de canola.

Havendo necessidade de acréscimo de nova dose ou tempo nestas curvas, os animais serão solicitados via adendo ao projeto com a respectiva justificativa.

2. ESTUDO DO MECANISMO DE AÇÃO ENVOLVIDO NO EFEITO DO TIPO ANTIDEPRESSIVO DO SEBZF-S: SISTEMA SEROTONINÉRGICO

2A. Investigação do envolvimento do receptor 5-HT1A no efeito do tipo antidepressivo do SeBZF-S: uso de WAY 100635
Para a investigação do envolvimento do receptor serotoninérgico 5-HT1A no efeito do tipo antidepressivo do SeBZF-S, os camundongos serão pré-tratados com WAY100635 (0,1 mg/kg, s.c., antagonista seletivo do receptor 5-HT1A) ou salina. Após um período de 15 minutos da administração do antagonista, os animais serão tratados com o SeBZF-S (em uma dose efetiva) ou óleo de canola e então serão submetidos ao TSC.
2B. Investigação do envolvimento do receptor 5-HT2A/2C no efeito do tipo antidepressivo do SeBZF-S: uso de quetanserina
Os camundongos serão pré-tratados com quetanserina (1 mg/kg, i.p., antagonista não seletivo de receptores 5-HT2A/2C) ou salina. Após um período de 15 minutos da administração do antagonista, os animais serão tratados com o SeBZF-S (v.o.) ou óleo de canola em uma dose efetiva e submetidos ao TSC.
2C. Investigação do envolvimento do receptor 5-HT3 no efeito do tipo antidepressivo do SeBZF-S: uso de ondansetrona
Os camundongos serão pré-tratados com ondansetrona (1 mg/kg, i.p., antagonista não seletivo de receptores 5-HT3) ou salina. Após um período de 15 minutos da administração do antagonista, os animais serão tratados com o SeBZF-S (v.o.) ou óleo de canola em uma dose efetiva e submetidos ao TSC.
2D. Investigação do possível efeito sinergístico com um ISRS via uso de fluoxetina
Nós também investigaremos a possível interação entre administrações orais de doses subefetivas do SeBZF-S selecionado (a ser determinada) e fluoxetina (5 mg/kg) (Gall et al. 2020). Para esta proposta, os animais receberão fluoxetina ou salina, e após 10 min receberão o SeBZF-S, ambos em doses que não produzem efeito por si só. O possível efeito sinergístico será avaliado após 30 min da administração do SeBZF-S no TSC.

3. ESTUDO DE TOXICIDADE ORAL AGUDA
Para avaliar a possível toxicidade do SeBZF-S selecionado, os camundongos receberão uma única dose oral do composto selecionado na dose de 300 mg/kg (dose sugerida pela OECD) ou veículo (óleo de canola ). Serão utilizados camundongos com jejum de 3-4h antes da administração e com variação de no máximo 20% do peso corporal. Os animais serão observados a cada 30 min durante as primeiras 24h e depois diariamente por 14 dias (OECD) para determinar o potencial letal dos compostos. Peso corporal, consumo hídrico e alimentar, locomoção e aspecto do animal serão avaliados. Conforme indicado no protocolo o experimento avaliará inicialmente 3 animais por grupo num primeiro momento, e posteriormente repetido, resultando em um N de 6 animais/grupo.
Após este tempo de exposição, os camundongos serão anestesiados com isoflurano para o procedimento de punção cardíaca e o sangue será coletado em tubos contendo heparina. O plasma será obtido após centrifugação e usado para ensaios bioquímicos através de kits comerciais. As atividades das enzimas aspartato aminotransferase (AST) e alanina aminotransferase (ALT) no plasma serão usadas como indicadores de função hepática. A função renal será avaliada pela dosagem dos níveis plasmáticos de uréia.
OECD/OCDE 423. Adopted: 17th December 2001. OECD GUIDELINE FOR TESTING OF CHEMICALS. Acute Oral Toxicity – Acute Toxic Class Method

4. ESTUDO DE DOCKING MOLECULAR
Com o intuito de reforçar os achados comportamentais, a técnica de docagem molecular será realizada para predizer a possível interação do composto com os receptores serotoninérgicos. Trata-se de estudos computacionais e, portanto, não envolve o uso de animais. Docking molecular ou ancoragem molecular é uma ferramenta chave para predizer a melhor orientação de ajuste de um ligante em uma proteína. Essa abordagem nos permite caracterizar o comportamento de pequenas moléculas no sítio de ligação das proteínas alvo, assim como, elucidar as interações moleculares.

Indicadores, Metas e Resultados

Espera-se identificar uma molécula com potencialidade para o desenvolvimento de uma nova terapia voltada ao tratamento de transtornos psiquiátricos, tais como a depressão. Além disso, almeja-se que ela possua baixo risco de gerar efeitos adversos, e espera-se contribuir na elucidação de seus mecanismos de ação através do emprego de pesquisa pré-clínica. Por fim, espera-se contribuir na formação de recursos humanos no PPGBBio e envolver alunos de iniciação científica. Anseia-se pela geração de resumos, artigos científicos e possível patente.

Equipe do Projeto

NomeCH SemanalData inicialData final
CESAR AUGUSTO BRUNING1
CRISTIANI FOLHARINI BORTOLATTO3
DIANER NÖRNBERG STRELOW
Ediandra Tissot Castro
Estela Hartwig Ribeiro
ILA YASMIM REIS AROUCHE DANTAS
JOSÉ SEBASTIÃO DOS SANTOS NETO
LARISSA SANDER MAGALHÃES
LUIZ FELIPE ARAUJO
MARIANA PARRON PAIM
NATALIA GONCALVES TAVARES
RAYANE GONCALVES DE OLIVEIRA
TAIS DA SILVA TEIXEIRA RECH

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