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A compreensão da relação entre o conteúdo lipídico de embriões e o estresse oxidativo, sejam eles causas, consequências, ou uma associação mútua entre ambos, permitirá testar as seguintes hipóteses: de que o consumo lipídico reduzirá os níveis de EROS através da regulação metabólica promovida pelo balanceamento das vias de glicólise e pentose-fosfato obtidas com a suplementação de PES, favorecendo o desenvolvimento embrionário inicial; de que o conteúdo lipídico de embriões pode ser elevado pela indução de EROS através de suplementação com H2O2, ou reduzido/mantido aos níveis do tratamento controle pelo uso do resveratrol perante a suplementação com H2O ; e de que o uso combinado de PES e resveratrol poderá favorecer o desenvolvimento embrionário, tanto pela regulamentação metabólica, como pela proteção contra o estresse oxidativo. Caso essas hipóteses se confirmem, será possível determinar que o aumento do conteúdo lipídico em embriões suínos produzidos in vitro representa um mecanismo de proteção ao estresse oxidativo, sendo reversível com melhor equilíbrio metabólico e/ou com suplementação de antioxidante.

Ovários de fêmeas suínas pré-púberes serão coletados em um abatedouro local e transportados ao laboratório em solução 0,9% NaCl à 37-39°C. Folículos com 3-6 mm de diâmetro terão seu conteúdo aspirado com uma agulha de 19 G conectada a um sistema de vácuo (10-15 mL/min). Os complexos cumulus oophorus-ovócitos (CCOs) serão removidos do fluído folicular e, após a sedimentação, coletados com auxílio de estereomicroscópio e colocados em uma placa contendo o meio de manutenção TCM-HEPES (TCM-199 com 0,1% de PVA, 2mM C3H4O3 e 2,5mM NaHCO3). Os CCOs contendo ovócitos com citoplasma homogêneo e pelo menos três camadas de células do cumulus oophorus serão selecionados e lavados novamente em TCM-HEPES, antes do início da MIV.
Serão utilizadas placas de multipoços Nunc com 30-40 CCOs por poço contendo 400 μL do meio de maturação TCM-MIV (TCM-199 suplementado com 0,1% de PVA,2,5 mM de NaHCO3, 0,57 mM cisteína, 0,91mM de C3H3NaO3, 0,001 g/mL de EGF, 0,05 g/mL de estreptomicina e 0,065 g/mL de penicilina) por 44 h a 38,5°C, em atmosfera com 5% CO2 e máxima umidade. Nas primeiras 22 h de MIV, o meio será suplementado com gonadotrofinas (20 μg/μL de FSH e 5 μg/μL de LH), constituindo o meio controle a ser usado em todos os experimentos. Os moduladores a serem testados serão adicionados ao meio controle, para compor os demais tratamentos. Caso as taxas de clivagem obtidas sejam consideradas insuficientes (inferiores a 70% no D2), será realizada a adição de 25% de pFF ao meio controle durante a MIV, para impulsionar o desenvolvimento embrionário.
O fluido folicular será obtido de ovários de fêmeas suínas pré-púberes coletados em um abatedouro local e transportados ao laboratório em solução 0,9% NaCl à 37-39°C. O fluido folicular será aspirado de folículos com 3-6 mm de diâmetro através uma agulha de 19 G conectada em uma linha de vácuo (10 - 15 mL/min) e armazenado em tubos de 15 mL. Depois que os detritos celulares se estabelecerem por 20 min, os tubos serão centrifugados por 15 min a 400 x g. O sobrenadante será aspirado e filtrado duas vezes através de filtros de 0,45 μm e 0,22 μm, respectivamente. As alíquotas de 1 mL serão armazenadas a -20°C até o uso, caso necessário.
Ao final da MIV, os CCOs serão desnudados por agitação mecânica por 5 min em meio TCM-MIV e submetidos ao processo de ativação partenogenética. Os ovócitos serão lavados duas vezes em TCM-HEPES suplementado com albumina sérica bovina livre de ácido graxo (BSA-FAF). Após, serão incubados em 15 μM ionomicina durante 4 min, lavados em BSA-FAF e incubados por 4 h em meio PZM suplementado com cálcio, hipotaurina, glutamina, BSA-FAF, estrôncio, citocalasina B e cicloheximida. Após a ativação (dia zero; D0), os prováveis embriões partenotos serão cultivados em gotas de 60 μL de PZM (+) sob óleo mineral. As taxas de clivagem serão determinadas no D1 e D2 e as taxas de blastocisto no D7. No D5, será realizado o feeding, alterando 50% da gota, com a adição de 10% de soro de égua em estro (EMS). Ao final do cultivo, todos os embriões serão fixados em paraformaldeído 4% por 30 min e armazenados em PBS (D7) para futuras avaliações, com exceção dos embriões submetidos a vitrificação e aquecimento (D5).
Experimento 1 – Efeito tempo-dependente de PES no desenvolvimento embrionário, estresse oxidativo e conteúdo lipídico de embriões
A mesma concentração de PES (0,05 µM) será utilizada durante todo o experimento. Serão realizadas cinco replicações de CIV, utilizando quatro grupos: Controle sem PES; e tratamentos com adição de 0,0 5µM de PES em três períodos (T1= 0-24 h, T2= 24-48 h e T3= 0-48 h). Após a CIV, os embriões serão fixados e armazenados até futuras avaliações.
Experimento 2 – Efeito tempo-dependente de RES no desenvolvimento embrionário, estresse oxidativo e conteúdo lipídico de embriões
A mesma concentração de resveratrol (2 µM) será utilizada durante todo o experimento. Serão realizadas cinco replicações de CIV utilizando quatro grupos: Controle sem resveratrol; e tratamentos com adição de resveratrol em três períodos (T1= 0-24 h, T2= 24-48 h e T3= 0-48 h). Após a CIV, os embriões serão fixados e armazenados até futuras avaliações.
Experimento 3 – Efeito tempo-dependente de H2O2 no desenvolvimento embrionário, estresse oxidativo e conteúdo lipídico de embriões
A mesma concentração de peróxido de hidrogênio (50 µM) será utilizada durante todo o experimento. Após a ativação partenogenética, os prováveis embriões serão previamente tratados com 1 mM de H2O2 por 30 min em meio PZM, a fim de eliminar os efeitos de superóxido dismutase. Ao final deste tratamento, os embriões serão lavados em PZM e submetidos a CIV. Serão realizadas cinco replicações usando quatro grupos: Controle sem H2O2; e tratamentos com adição de H2O2 em três períodos (T1= 0-24 h, T2= 24-48 h e T3= 0-48 h). Após a CIV, os embriões serão fixados e armazenados até futuras avaliações
Experimento 4 – Comparativo entre os tratamentos e efeito da combinação PES/Resveratrol/H2O2 no desenvolvimento embrionário, no conteúdo lipídico, no estresse oxidativo e na expressão gênica de embriões
Serão realizadas duas etapas com cinco replicações cada, nas quais os embriões passarão pelo mesmo tratamento prévio com 1 mM H2O2 descrito acima. Para ambas as etapas, os períodos e concentrações dos tratamentos serão definidos com base nos resultados dos experimentos anteriores. A primeira etapa visa comparar os tratamentos e será constituída de quatro grupos: Controle, PES, Resveratrol e H2O2. A segunda parte visa combinar os tratamentos anteriores e será constituída por cinco grupos: Controle, PES + Resveratrol, PES + H2O2, Resveratrol + H2O2 e PES + Resveratrol + H2O2. Após a CIV, os embriões obtidos serão submetidos a contagem de blastômeros, quantificação lipídica, análise da expressão gênica, quantificação de EROS e a avaliação de viabilidade pós-vitrificação.
Para a contagem das células embriões fixados de todos os experimentos serão corados com 7,5 μg/ml de Hoechst 33342 por 10 min. As estruturas coradas serão colocadas em lâminas contendo uma única gota de Mowiol coberta com lamínulas e avaliadas por microscopia de epifluorescência.
Para medir o conteúdo lipídico, embriões fixados de todos os experimentos serão corados com 1 μg/mL de Nile Red overnight. Após a coloração, os ovócitos e embriões serão lavados em PBS e colocados em uma gota de Mowiol entre lâmina e lamínulas. Para a quantificação lipídica, as imagens serão obtidas por microscopia de epifluorescência, utilizando um filtro G2A com resolução 1920 x 1080 e exposição de 80 ms. A intensidade da fluorescência será determinada apenas pelo citoplasma dos embriões com a ferramenta de desenho à mão livre do software Image J®, na qual os valores serão ajustados pela Fluorescência total celular corrigida: CTCF = Densidade integrada - (Área da célula selecionada X Fluorescência média das leituras de fundo).
Para a quantificação das EROS, embriões fixados serão incubados no escuro por 30 min em TLH-PVA adicionado de 10 µM H2DCFDA. Após a incubação, os embriões serão lavados em PBS+PVA, e colocados em uma única gota de Mowiol entre lâmina e lamínula. A fluorescência será observada em microscópio de epifluorescência com filtros UV (460nm). As imagens fluorescentes serão salvas como arquivos gráficos no formato TIFF e as intensidades de fluorescência do citoplasma dos embriões serão analisadas pelo software Image J®, nas quais os valores serão ajustados pela CTCF.
Para a análise da expressão gênica, o RNA total de cada pool de ovócitos ou embriões (mínimo de 30 ovócitos ou 5 embriões/pool) será extraído por protocolo baseado em colunas de sílica ou trizol. Para quantificar o RNA extraído, a densidade ótica será determinada com espectrofotômetro NanoDrop, em um comprimento de onda de 260 nm. A pureza do RNA será avaliada através da taxa de absorção da relação OD260/OD280, de forma que não serão utilizados valores inferiores a 1,8. O RNA total obtido (200 ng) será tratado com DNase a 37°C por 5 min para digerir qualquer DNA contaminante. Após a inativação da DNase a 65°C por 10 min, a reação de transcrição reversa será realizada com o kit iScript cDNA Synthesis. A expressão relativa dos genes será realizada por PCR em tempo real (CFX 384, BioRad) e a variabilidade na quantidade de RNAm será corrigida pela amplificação, minimamente, dos genes constitutivos GAPDH e β-actina.
O procedimento de vitrificação e aquecimento será realizado usando o sistema OPS. Grupos de blastocistos em D5 classificados como grau 1 e 2 serão selecionados (+/- 10) e lavados em TCM-HEPES + 20% soro fetal bovino (SFB), após, serão expostos a solução de estabilização (SE: HEPES-199, 20% SFB, 7,5% etileno glicol (EG), 7,5% dimetilsulfóxido à 38,5º C por 3 min. Os blastocistos serão transferidos para a solução de vitrificação (TCM-HEPES, 20% SFB, 17% EG, 17% DMSO, 0,4M sacarose). Os embriões serão envasados em OPS e submersos em nitrogênio líquido após 30 s. As OPS contendo os embriões serão armazenadas em botijão criogênico até o momento de seu aquecimento.
Para o aquecimento, cada OPS será imersa em solução de aquecimento (TCM-HEPES, +20% SFB+ 0,13M SAC) por 5 min. Após, os blastocistos serão transferidos para uma segunda solução de aquecimento (TCM-HEPES+ 20% SFB+0,075M SAC) por 5 min, sendo, por fim, lavados por 5 min em meio TCM-HEPES+20% SFB). Ao final do processo, os blastocistos serão lavados em PZM (+) contendo 10% EMS e transferidos o CIV. Após 48 h, os blastocistos serão avaliados quanto a taxa de reexpansão da blastocele e quanto ao estágio de desenvolvimento como parâmetro de tolerância ao processo de vitrificação.

Determinar se as taxas de clivagem, de produção de blastocistos e o número de blastômeros dos embriões são influenciados pelos tratamentos;
Definir se o conteúdo lipídico total e a produção de EROS dos embriões estão correlacionados e são influenciados pelos tratamentos;
Determinar a influência dos tratamentos sobre a expressão relativa de genes envolvidos na síntese de GL, no estresse oxidativo e no desenvolvimento dos embriões;
Determinar a influência dos tratamentos, do conteúdo lipídico, do estresse oxidativo e da expressão gênica sobre a resistência à criopreservação dos embriões.
Uma tese de doutorado