Nome do Projeto
Causa ou consequência? Relação entre o conteúdo lipídico e a ocorrência de estresse oxidativo em embriões suínos desenvolvidos in vitro
Ênfase
Pesquisa
Data inicial - Data final
29/10/2021 - 30/10/2024
Unidade de Origem
Coordenador Atual
Área CNPq
Ciências Agrárias
Resumo
A assincronia entre a maturação nuclear e a citoplasmática é um dos fatores que limitam a produção in vitro (PIV) de embriões suínos, devido ao aumento no conteúdo de lipídios e de espécies reativas de oxigênio (EROS) no citoplasma de ovócitos e embriões processados in vitro. Ao final da maturação folicular, ocorre queda nos níveis da adenosina monofosfato cíclica (AMPc) produzida por folículos antrais, fazendo com que os ovócitos retornem à meiose pela ativação da cadeia do fator promotor da maturação (FPM). Quando os complexos cumulus oophorus-ovócito são removidos do ambiente folicular para uso na maturação in vitro (MIV), ocorre o desbloqueio do FPM e o ovócito retoma a meiose prematuramente em relação ao citoplasma. A incorreta maturação citoplasmática resulta em uma produção excessiva de EROS. Durante o crescimento folicular, ocorre a formação de gotículas lipídicas (GL) intracelulares, seja pela síntese de lipídeos neutros, pela troca de conteúdo lipídico entre as GL ou pela incorporação de ácidos graxos para síntese lipídica. Através da expressão de genes relacionados ao metabolismo de ácidos graxos nas células do cumulus oophorus, estes ácidos graxos são incorporados pelo ovócitos, armazenados nas GL e consumidos através do metabolismo oxidativo durante a maturação. As EROS são subprodutos do metabolismo oxidativo, gerando adenosina trifosfato através da redução de oxigênio pelas mitocôndrias. Altos níveis de EROS podem gerar estresse oxidativo, levando a peroxidação lipídica, quebra da dupla fita de DNA e mutação do DNA mitocondrial, reduzindo a viabilidade de ovócitos e embriões. Estratégias convencionais para melhorar o desenvolvimento embrionário na PIV, visando a redução no conteúdo lipídico, foram baseadas na redução de EROS pela adição de antioxidantes ou de moduladores químicos. O uso do antioxidante resveratrol demonstrou ter efeito dose dependente em suínos. O resveratrol é um metabólito secundário de plantas, que aumenta a atividade de sirtuina através da inibição da fosfodiesterase. A sirtuina regula a biogênese das mitocôndrias, além de ter atividade relacionada com proteínas quinases, fosforilação oxidativa e oxidação de ácidos graxos. Outra abordagem seria o uso de Etosulfato de Fenazina (PES), um regulador metabólico que inibe a síntese de ácidos graxos pela oxidação de NADPH em NADP, reduzindo o conteúdo lipídico de embriões bovinos e suínos. Pesquisas envolvendo o desenvolvimento in vitro de embriões suínos relatam a utilização de fluído folicular (FF) durante a MIV, tornando o meio indefinido e dificultando a reprodução de seus resultados, já que apenas determinadas frações do FF são necessárias para a correta maturação in vitro. O uso de um meio quimicamente definido torna possível uma melhor determinação do efeito dos aditivos, sendo que a suplementação do meio de MIV com o fator de crescimento da epiderme é suficiente para atingir níveis de desenvolvimento embrionário semelhantes aos obtidos com uso de FF. Resultados preliminares do nosso laboratório demonstraram redução no conteúdo lipídico de ovócitos maturados em meio quimicamente definido.

Objetivo Geral

Determinar os níveis lipídicos e de estresse oxidativo de embriões suínos tratados com Resveratrol, H2O2 e Etosulfato de Fenazina durante o cultivo in vitro.

Justificativa

A compreensão da relação entre o conteúdo lipídico de embriões e o estresse oxidativo, sejam eles causas, consequências, ou uma associação mútua entre ambos, permitirá testar as seguintes hipóteses: de que o consumo lipídico reduzirá os níveis de EROS através da regulação metabólica promovida pelo balanceamento das vias de glicólise e pentose-fosfato obtidas com a suplementação de PES, favorecendo o desenvolvimento embrionário inicial; de que o conteúdo lipídico de embriões pode ser elevado pela indução de EROS através de suplementação com H2O2, ou reduzido/mantido aos níveis do tratamento controle pelo uso do resveratrol perante a suplementação com H2O ; e de que o uso combinado de PES e resveratrol poderá favorecer o desenvolvimento embrionário, tanto pela regulamentação metabólica, como pela proteção contra o estresse oxidativo. Caso essas hipóteses se confirmem, será possível determinar que o aumento do conteúdo lipídico em embriões suínos produzidos in vitro representa um mecanismo de proteção ao estresse oxidativo, sendo reversível com melhor equilíbrio metabólico e/ou com suplementação de antioxidante.

Metodologia

Ovários de fêmeas suínas pré-púberes serão coletados em um abatedouro local e transportados ao laboratório em solução 0,9% NaCl à 37-39°C. Folículos com 3-6 mm de diâmetro terão seu conteúdo aspirado com uma agulha de 19 G conectada a um sistema de vácuo (10-15 mL/min). Os complexos cumulus oophorus-ovócitos (CCOs) serão removidos do fluído folicular e, após a sedimentação, coletados com auxílio de estereomicroscópio e colocados em uma placa contendo o meio de manutenção TCM-HEPES (TCM-199 com 0,1% de PVA, 2mM C3H4O3 e 2,5mM NaHCO3). Os CCOs contendo ovócitos com citoplasma homogêneo e pelo menos três camadas de células do cumulus oophorus serão selecionados e lavados novamente em TCM-HEPES, antes do início da MIV.
Serão utilizadas placas de multipoços Nunc com 30-40 CCOs por poço contendo 400 μL do meio de maturação TCM-MIV (TCM-199 suplementado com 0,1% de PVA,2,5 mM de NaHCO3, 0,57 mM cisteína, 0,91mM de C3H3NaO3, 0,001 g/mL de EGF, 0,05 g/mL de estreptomicina e 0,065 g/mL de penicilina) por 44 h a 38,5°C, em atmosfera com 5% CO2 e máxima umidade. Nas primeiras 22 h de MIV, o meio será suplementado com gonadotrofinas (20 μg/μL de FSH e 5 μg/μL de LH), constituindo o meio controle a ser usado em todos os experimentos. Os moduladores a serem testados serão adicionados ao meio controle, para compor os demais tratamentos. Caso as taxas de clivagem obtidas sejam consideradas insuficientes (inferiores a 70% no D2), será realizada a adição de 25% de pFF ao meio controle durante a MIV, para impulsionar o desenvolvimento embrionário.
O fluido folicular será obtido de ovários de fêmeas suínas pré-púberes coletados em um abatedouro local e transportados ao laboratório em solução 0,9% NaCl à 37-39°C. O fluido folicular será aspirado de folículos com 3-6 mm de diâmetro através uma agulha de 19 G conectada em uma linha de vácuo (10 - 15 mL/min) e armazenado em tubos de 15 mL. Depois que os detritos celulares se estabelecerem por 20 min, os tubos serão centrifugados por 15 min a 400 x g. O sobrenadante será aspirado e filtrado duas vezes através de filtros de 0,45 μm e 0,22 μm, respectivamente. As alíquotas de 1 mL serão armazenadas a -20°C até o uso, caso necessário.
Ao final da MIV, os CCOs serão desnudados por agitação mecânica por 5 min em meio TCM-MIV e submetidos ao processo de ativação partenogenética. Os ovócitos serão lavados duas vezes em TCM-HEPES suplementado com albumina sérica bovina livre de ácido graxo (BSA-FAF). Após, serão incubados em 15 μM ionomicina durante 4 min, lavados em BSA-FAF e incubados por 4 h em meio PZM suplementado com cálcio, hipotaurina, glutamina, BSA-FAF, estrôncio, citocalasina B e cicloheximida. Após a ativação (dia zero; D0), os prováveis embriões partenotos serão cultivados em gotas de 60 μL de PZM (+) sob óleo mineral. As taxas de clivagem serão determinadas no D1 e D2 e as taxas de blastocisto no D7. No D5, será realizado o feeding, alterando 50% da gota, com a adição de 10% de soro de égua em estro (EMS). Ao final do cultivo, todos os embriões serão fixados em paraformaldeído 4% por 30 min e armazenados em PBS (D7) para futuras avaliações, com exceção dos embriões submetidos a vitrificação e aquecimento (D5).
Experimento 1 – Efeito tempo-dependente de PES no desenvolvimento embrionário, estresse oxidativo e conteúdo lipídico de embriões
A mesma concentração de PES (0,05 µM) será utilizada durante todo o experimento. Serão realizadas cinco replicações de CIV, utilizando quatro grupos: Controle sem PES; e tratamentos com adição de 0,0 5µM de PES em três períodos (T1= 0-24 h, T2= 24-48 h e T3= 0-48 h). Após a CIV, os embriões serão fixados e armazenados até futuras avaliações.
Experimento 2 – Efeito tempo-dependente de RES no desenvolvimento embrionário, estresse oxidativo e conteúdo lipídico de embriões
A mesma concentração de resveratrol (2 µM) será utilizada durante todo o experimento. Serão realizadas cinco replicações de CIV utilizando quatro grupos: Controle sem resveratrol; e tratamentos com adição de resveratrol em três períodos (T1= 0-24 h, T2= 24-48 h e T3= 0-48 h). Após a CIV, os embriões serão fixados e armazenados até futuras avaliações.
Experimento 3 – Efeito tempo-dependente de H2O2 no desenvolvimento embrionário, estresse oxidativo e conteúdo lipídico de embriões
A mesma concentração de peróxido de hidrogênio (50 µM) será utilizada durante todo o experimento. Após a ativação partenogenética, os prováveis embriões serão previamente tratados com 1 mM de H2O2 por 30 min em meio PZM, a fim de eliminar os efeitos de superóxido dismutase. Ao final deste tratamento, os embriões serão lavados em PZM e submetidos a CIV. Serão realizadas cinco replicações usando quatro grupos: Controle sem H2O2; e tratamentos com adição de H2O2 em três períodos (T1= 0-24 h, T2= 24-48 h e T3= 0-48 h). Após a CIV, os embriões serão fixados e armazenados até futuras avaliações
Experimento 4 – Comparativo entre os tratamentos e efeito da combinação PES/Resveratrol/H2O2 no desenvolvimento embrionário, no conteúdo lipídico, no estresse oxidativo e na expressão gênica de embriões
Serão realizadas duas etapas com cinco replicações cada, nas quais os embriões passarão pelo mesmo tratamento prévio com 1 mM H2O2 descrito acima. Para ambas as etapas, os períodos e concentrações dos tratamentos serão definidos com base nos resultados dos experimentos anteriores. A primeira etapa visa comparar os tratamentos e será constituída de quatro grupos: Controle, PES, Resveratrol e H2O2. A segunda parte visa combinar os tratamentos anteriores e será constituída por cinco grupos: Controle, PES + Resveratrol, PES + H2O2, Resveratrol + H2O2 e PES + Resveratrol + H2O2. Após a CIV, os embriões obtidos serão submetidos a contagem de blastômeros, quantificação lipídica, análise da expressão gênica, quantificação de EROS e a avaliação de viabilidade pós-vitrificação.
Para a contagem das células embriões fixados de todos os experimentos serão corados com 7,5 μg/ml de Hoechst 33342 por 10 min. As estruturas coradas serão colocadas em lâminas contendo uma única gota de Mowiol coberta com lamínulas e avaliadas por microscopia de epifluorescência.
Para medir o conteúdo lipídico, embriões fixados de todos os experimentos serão corados com 1 μg/mL de Nile Red overnight. Após a coloração, os ovócitos e embriões serão lavados em PBS e colocados em uma gota de Mowiol entre lâmina e lamínulas. Para a quantificação lipídica, as imagens serão obtidas por microscopia de epifluorescência, utilizando um filtro G2A com resolução 1920 x 1080 e exposição de 80 ms. A intensidade da fluorescência será determinada apenas pelo citoplasma dos embriões com a ferramenta de desenho à mão livre do software Image J®, na qual os valores serão ajustados pela Fluorescência total celular corrigida: CTCF = Densidade integrada - (Área da célula selecionada X Fluorescência média das leituras de fundo).
Para a quantificação das EROS, embriões fixados serão incubados no escuro por 30 min em TLH-PVA adicionado de 10 µM H2DCFDA. Após a incubação, os embriões serão lavados em PBS+PVA, e colocados em uma única gota de Mowiol entre lâmina e lamínula. A fluorescência será observada em microscópio de epifluorescência com filtros UV (460nm). As imagens fluorescentes serão salvas como arquivos gráficos no formato TIFF e as intensidades de fluorescência do citoplasma dos embriões serão analisadas pelo software Image J®, nas quais os valores serão ajustados pela CTCF.
Para a análise da expressão gênica, o RNA total de cada pool de ovócitos ou embriões (mínimo de 30 ovócitos ou 5 embriões/pool) será extraído por protocolo baseado em colunas de sílica ou trizol. Para quantificar o RNA extraído, a densidade ótica será determinada com espectrofotômetro NanoDrop, em um comprimento de onda de 260 nm. A pureza do RNA será avaliada através da taxa de absorção da relação OD260/OD280, de forma que não serão utilizados valores inferiores a 1,8. O RNA total obtido (200 ng) será tratado com DNase a 37°C por 5 min para digerir qualquer DNA contaminante. Após a inativação da DNase a 65°C por 10 min, a reação de transcrição reversa será realizada com o kit iScript cDNA Synthesis. A expressão relativa dos genes será realizada por PCR em tempo real (CFX 384, BioRad) e a variabilidade na quantidade de RNAm será corrigida pela amplificação, minimamente, dos genes constitutivos GAPDH e β-actina.
O procedimento de vitrificação e aquecimento será realizado usando o sistema OPS. Grupos de blastocistos em D5 classificados como grau 1 e 2 serão selecionados (+/- 10) e lavados em TCM-HEPES + 20% soro fetal bovino (SFB), após, serão expostos a solução de estabilização (SE: HEPES-199, 20% SFB, 7,5% etileno glicol (EG), 7,5% dimetilsulfóxido à 38,5º C por 3 min. Os blastocistos serão transferidos para a solução de vitrificação (TCM-HEPES, 20% SFB, 17% EG, 17% DMSO, 0,4M sacarose). Os embriões serão envasados em OPS e submersos em nitrogênio líquido após 30 s. As OPS contendo os embriões serão armazenadas em botijão criogênico até o momento de seu aquecimento.
Para o aquecimento, cada OPS será imersa em solução de aquecimento (TCM-HEPES, +20% SFB+ 0,13M SAC) por 5 min. Após, os blastocistos serão transferidos para uma segunda solução de aquecimento (TCM-HEPES+ 20% SFB+0,075M SAC) por 5 min, sendo, por fim, lavados por 5 min em meio TCM-HEPES+20% SFB). Ao final do processo, os blastocistos serão lavados em PZM (+) contendo 10% EMS e transferidos o CIV. Após 48 h, os blastocistos serão avaliados quanto a taxa de reexpansão da blastocele e quanto ao estágio de desenvolvimento como parâmetro de tolerância ao processo de vitrificação.

Indicadores, Metas e Resultados

Determinar se as taxas de clivagem, de produção de blastocistos e o número de blastômeros dos embriões são influenciados pelos tratamentos;
Definir se o conteúdo lipídico total e a produção de EROS dos embriões estão correlacionados e são influenciados pelos tratamentos;
Determinar a influência dos tratamentos sobre a expressão relativa de genes envolvidos na síntese de GL, no estresse oxidativo e no desenvolvimento dos embriões;
Determinar a influência dos tratamentos, do conteúdo lipídico, do estresse oxidativo e da expressão gênica sobre a resistência à criopreservação dos embriões.
Uma tese de doutorado

Equipe do Projeto

NomeCH SemanalData inicialData final
ALINNE MACHADO PETRARCA LÉO
ARNALDO DINIZ VIEIRA9
BERNARDO GARZIERA GASPERIN7
JOSÉ VICTOR CARDOSO BRAGA
OLENKA ROCHA PAIVA
RAFAEL GIANELLA MONDADORI9
THOMAZ LUCIA JUNIOR9

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