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O aumento no uso de fármacos na medicina veterinária tornou-se uma motivação para pesquisadores investigarem o potencial impacto da contaminação ambiental devido a essas substâncias. Existem evidencias de que estrógenos naturais produzidos por humanos ou animais, como 17β-estradiol (E2) e estrona, possam causar reversão sexual em peixes expostos a ambientes com presença dessas moléculas.
Químicos sintéticos conhecidos como xenoestrogenos, como 17β-estradiol-3-benzoato, foram recentemente associados com distúrbios ecológicos na vida marinha. Em animais, hormônios estão fisiologicamente presentes em diversos órgãos. Em vacas gestantes, a concentração acumulada de estrógenos no leite, tanto livre como conjugado, durante o terceiro trimestre de gestação pode ser 30 vezes maior do que a observada no primeiro trimestre. Outros estudos mostram que a concentração de estrógeno conjugado no leite pode variar de 2 a 65 pg/mL. A quantidade de estrógenos ingerido por pessoa pode atingir 10-54 ng/d. Embora essa ingestão estimada esteja abaixo do limite considerado prejudicial para humanos adultos, seu efeito cumulativo ao longo do tempo é desconhecido.
Nesse cenário, há dúvidas se os químicos comumente utilizados em protocolos veterinários para melhorar o desempenho reprodutivo, como hormônios exógenos, podem ser depositados em altas concentrações no meio ambiente. Esses protocolos podem ser usados para controlar o ciclo estral em vacas, para permitir a produção e transferência de embriões in vitro e para induzir artificialmente a lactação em vacas não gestantes.
Particularmente no bovino leiteiro, os distúrbios reprodutivos podem prejudicar a desempenho, resultando em intervalo de parto prolongados, baixa produção de leite e perdas financeiras. Para evitar custos da substituição prematura de vacas, protocolos que imitam o perfil endócrino durante a gestação e a lactação, por meio da administração de 20-30 mg/d de benzoato de estradiol em vacas não gestantes, por uma ou duas semanas, são amplamente utilizados para induzir lactações, permitindo uma produção de leite satisfatória. Por outro lado, existe a preocupação com a possível liberação de resíduos dessas drogas no leite, o que pode ter consequências para a saúde humana. Na Europa, o ato legislativo 2003/74 da Comissão Europeia proíbe o uso de pelo menos seis hormônios para fins de promoção de crescimento. Essa legislação se baseia em estudos que avaliaram potenciais efeitos endócrinos, imunológicos, neurobiológicos, genotóxicos e carcinogênicos, e recomenda a substituição dessas substâncias sempre que possível, especialmente o estrogênio e seus ésteres derivados, mesmo para fins terapêuticos.
Em relação ao potencial de distúrbios endócrinos causados por esses hormônios nos recursos hídricos, há uma atenção especial para a feminização dos peixes machos, distúrbios reprodutivos, infertilidade, câncer e interrupção do crescimento de certas espécies. Entre os rebanhos mais comuns, o esterco de vacas leiteiras tem a maior concentração de estrógênos. Estima-se que 20-40% dos estrogênios residuais estão nas fezes e podem ser liberados a uma taxa de 148-165 µg/d por vaca.
Essas investigações sugerem que existe potencial de contaminação de águas superficiais e subterrâneas, embora seu impacto biológico dependa das características do local de ocorrência. No Reino Unido, estrógenos foram detectados em nascentes e em canais de drenagem de campos agrícolas, próximos a fazendas de bovinos e ovinos, em níveis que excedem a concentração que garante a ausência de efeitos tóxicos em peixes. Para estratégias preventivas, os dejetos deveriam ser previamente tratados para reduzir ou eliminar a presença de esse tipo de molécula, antes de serem destinados ao ambiente.
Para os resíduos sólidos (esterco, lodo), a compostagem pode reduzir a presença de produtos farmacêuticos em 40 dias. No caso de efluentes (dejetos líquidos), a digestão anaeróbia também tem o potencial de diminuir a toxicidade de tais produtos químicos. Em alguns casos, a redução pode não ser suficiente. Portanto, alternativas inovadoras ainda estão em desenvolvimento, como membranas poliméricas para tratamento avançado de efluentes.
Os desreguladores endócrinos têm se tornado cada vez mais estudados na toxicologia reprodutiva e ambiental por meio de indicadores biológicos. Embriões de peixe-zebra (Danio rerio) são comumente usados para avaliar a toxicidade e investigar os efeitos dos estrógênos na formação e na função dos órgãos. Por meio de análises de expressão gênica em minhocas (Eisenia fetida) foi identificado que que os estrógenos geram estresse oxidativo no microambiente celular dessa espécie, bem como efeitos tóxicos nas populações de nematoides.
A criação de bovinos conta com poucas alternativas para o controle de carrapatos, que causam doenças em rebanhos. A aplicação através de banhos com fármacos denominados carrapaticidas (com diferentes métodos) é a alternativa mais usual. Porém, existe a preocupação tanto com relação à resistência contra esses fármacos, que podem se tornar ineficientes a longo prazo, como quanto à possibilidade de que estes possam trazer riscos para os consumidores. Um exemplo seria o difluorobenzoilureia (Fluazuron®), que possui longa vida residual nos tecidos e no leite. Além disso, essa prática também oferece riscos potenciais para contaminação ambiental do entorno e de recursos hídricos.
No entanto, o entendimento da influência de fármacos, como os estrógenos naturais e sintéticos e os carrapaticidas, nos sistemas biológicos ainda requer mais pesquisas para determinar a sua toxicidade. Além disso, não existem estudos investigando se os protocolos utilizados para a indução artificial de lactações em vacas podem contribuir para alterar os níveis de resíduos hormonais presentes no leite e a serem liberados no meio ambiente. Os métodos de avaliação precisam ser melhorados para confirmar se as moléculas usadas em protocolos veterinários estão relacionadas a riscos para a saúde humana e para o meio ambiente. Ainda, é preciso desenvolver alternativas capazes de reduzir a concentração de estrógenos nos resíduos sólidos e nos efluentes gerados nas atividades agrícolas.

Indução artificial da lactação (IAL)

Os protocolos de indução de lactação foram anteriormente aplicados em novilhas da raça Holandês, com média de 30 meses de idade e 430 kg, que apresentavam histórico de repetição de estros. Os protocolos foram aplicados em novilhas de uma propriedade rural da região sul do Rio Grande do Sul (30°S; 55° W), que eram mantidas em pasto natural, com suplementação alimentar com silagem e ração e acesso a água e sal mineral. As fêmeas foram alocadas a dois tratamentos (n = 5, em ambos): Grupo 1, protocolo padrão de IAL; e Grupo 2, protocolo curto. Um terceiro grupo (Grupo 3), composto por vacas que tiveram parto natural será utilizado como controle (n = 5).

O protocolo padrão de IAL consiste em aplicações de diversos hormônios: benzoato de estradiol (BE) (Gonadiol®, Zoetis produtos veterinários, Campinas, SP, Brasil), progesterona (P4) (Sincogest® Ourofino Saúde Animal, São Paulo, SP, Brasil), cloprostenol sódico (PGF) (Sincrocio® Ourofino saúde animal), dexametasona sódica (Cortifal® Ourofino saúde animal) e somatotropina bovina (bST) (Lactotropin® Elanco saúde animal, São Paulo, SP, Brasil). O protocolo curto se diferenciou do protocolo padrão, por não incluir aplicação de BE do dia -13 ao dia -08.


Coleta de amostras

Experimento 1

No 22° dia, amostras de leite (30 mL) serão coletadas nos dias 2, 5 e 10 após a ordenha, totalizando 45 amostras. A coleta será feita manualmente, em tubos de ensaio, após o descarte das primeiras gotas de leite. Amostras de fezes com volume aproximado de 1 L serão coletadas manualmente, diretamente do reto das vacas, nos dias -21, -14, -07, -02, 05 e 10, totalizando 90 amostras.

Experimento 2

Após o período de espera na mangueira, quando permanecerão apenas as fêmeas de cada grupo, serão coletados os dejetos em dois momentos: entre os dias -20 a -17; e entre os dias -13 a -10. Serão coletados aproximadamente 50 kg de dejetos por grupo, em cada um dos períodos. Todas as amostras serão mantidas resfriadas até serem congelados a -20°C, para posteriormente serem submetidas a compostagem.

Análises de estradiol no leite

Para a determinação dos níveis de estrógenos no leite, é importante considerar que a reduzida meia vida do BE indica que a sua ação farmacológica é estimada em três dias após a aplicação [29]. Além disso, como ocorre com outros ésteres de estradiol, é possível que o BE funcione no corpo do animal de forma semelhante ao 17β-estradiol, após a aplicação intramuscular [14]. Portando, nesse projeto é proposto a determinação da concentração de 17β-estradiol (E2) utilizando o estradiol ELISA kit (Números de catálogos CEA461Ge; ou DE4399; ou equivalente), conforme as instruções do fabricante, com adaptações [30], prioritariamente no dia 2 do protocolo.

Análises de BE nas fezes

Em estudo conduzido por Dunn et al. [31], altas concentrações de BE foram encontradas na urina, nas fezes e na bile, 24 horas após a aplicação do hormônio. O BE será analisado por cromatografia líquida de alta eficiência acoplada à espectrometria de massas sequencial (LC-MS/MS), conforme descrito na literatura [31]. Previamente, será realizado verificação pela técnica de recuperação, com uma curva padrão com soluções de 1, 2, 5 10, 20, 50 e 100 ng/mL, preparadas com o reagente puro nas diferentes matrizes de amostras (urina, fezes e adubos), obtendo um coeficiente de correlação linear superiores a 0,995, um percentual de recuperação superior a 50% e um limite de detecção igual ou superior a 0.1-0.5 µg/L. Os solventes orgânicos utilizados serão acetona, acetonitrila, metanol. N-hexano, diclorometano, acetato de etila, sulfato de sódio anidro e hidróxido de sódio. A limpeza das amostras e a etapa de extração será realizada com cartuchos Florisil (500 mg, 6mL), Cleanert NH2 (500 mg, 6 mL), Oasis HLB (200 mg, 6mL) e filtro nylon (0,22 µm). A filtração de amostras líquidas utilizará filtro de vibra de vidro GF-F (0,7 µm).

O pré-tratamento das amostras de fezes será feito com alíquota de 1 g de amostra seca e homogênea, misturado com Florisil e colocada na base de uma célula de extração. Será utilizado um solvente de extração acelerada, conforme protocolos adaptados, incluindo uma quarta etapa de limpeza com extração líquido-líquido (amostra evaporada reconstituída com acetonitrila misturada com hexano), extração alcalina (após reconstituição com NaOH e centrifugação) e hidrofílico-lipofilico balanço enriquecimento.

A análise de LC-MS/MS será realizada por equipamento HPLC (equivalente ao tipo escaneamento: MRM; fonte de íon: ESI; modo do ion: negativo; voltagem: -4.500 v; aquecimento turbo: 450°C; cur: 20 psi; gs1: 45 psi; gs2: psi), acoplado com espectrômetro de massa, equipado com software apropriado. Uma coluna “Nova-Pak” C18 HPLC (150 mm x 2,9 mm, 4µm), ou equivalente, será utilizada. A fase móvel utilizará soluções com acetonitrila, ácido fórmico e metanol, em diferentes concentrações conforme o tempo do perfil de gradiente de fluxo.

Tratamento das fezes por compostagem

Devido a possibilidade dos metabolitos hormonais se complexarem com a matéria orgânica [32], é proposto a compostagem das fezes com o objetivo de verificar os efeitos dessas substâncias após o processo de estabilização microbiana e físico-química do material.

Serão realizados ensaios de compostagem de bancada, com duração de 40 dias. As amostras coletadas nos dois períodos (entre os dias -20 a -17 e nos dias -13 a -10) serão homogenizadas e avaliadas em duplicatas. O reator utilizado para a compostagem, com capacidade de 80 L, é apresentado no Anexo 1. As fezes serão misturadas com maravalha, em uma mistura com relação C/N próxima a 30/1 e umidade entre 40-60%. O material será revolvido pela rotação completa do reator, duas vezes por semana, por 2 minutos. O registro da temperatura no interior do material será automatizado, em intervalos de 1 h. Amostras de cada tratamento serão colhidas nos dias 1 e 40, totalizado 12 amostras, com aproximadamente 1 kg cada. Como controle do processo serão analisados parâmetros físico-químicos (umidade, C, N, P, pH e condutividade elétrica).

Preparo de amostras com concentração conhecidas dos fármacos alvos

Os fármacos estudados serão adicionados em amostras de fezes e de composto orgânico, em concentrações previamente definidas conforme a literatura, para posterior exposição aos bioindicadores. O efeito dessas amostras será avaliado antes e após o tratamento por compostagem.

Para o BE serão adotadas concentrações (em ng/L) adaptadas de Essid et al. [7]: cBE1 = 0,43; cBE2 = 0,86; cBE3 = 4,3; cBE4 = 8,6; e cBE5 = 12,9. A cBE3 é equivalente à concentração esperada em ambientes contaminados.

Com relação aos carrapaticidas, serão utilizados dois produtos comerciais de uso recorrente no estado do Rio Grande do Sul, Brasil. As substâncias serão diluídas em 5 concentrações (mg/L): C1 = 0,01; C2 = 0,1; C3 = 0,5; C4 = 1,5; e C5 = 10.

Avaliação com bioindicadores

As matérias primas (fezes e maravalha) e as amostras coletas no ensaio de compostagem, assim como as amostras preparadas com concentrações conhecidas dos fármacos alvos, serão analisadas por bioindicadores.

Serão conduzidos teste com sementes de vegetais, que são rápidos, simples e sensíveis a efeitos fitotóxicos. Será avaliada a germinação de sementes de duas espécies, em extrato aquoso das amostras (1:10; m/v; 1h de agitação; filtração), aplicado em placas de petri com 10 sementes cada, e incubado por 48 h, à 25 °C no escuro [33]. Em seguida serão determinados o índice de germinação, o índice mitótico e a frequência de aberrações cromossômicas.

O teste com oligoguetas ou teste de fuga com minhocas (Eisenia andrei) é tão sensível quanto o teste de reprodução e de letalidade com esses organismos, diferenciando-se pelos efeitos subletais e pela simplicidade de execução. Este teste é utilizado para avaliar a qualidade de solos e efeitos de substâncias químicas no comportamento dos animais, a partir da exposição das minhocas em câmara com seções contendo solo padrão e porções da amostra, por 48 horas, permitindo que as minhocas escolham e indiquem a qualidade do solo através do comportamento de fuga ou preferência [34]. O teste reprodutivo também será considerado a partir da avaliação do teste anterior, no qual poderá ser avaliado o número dos casulos e a condição dos organismos juvenis.

O teste com microcrustáceos foi utilizado em estudos relacionados à toxicidade de substâncias farmacêuticas. O uso de Daphina magna permite identificar efeitos subletais e transgeracionais [35]. O teste de toxicidade aguda será realizado a partir da exposição de nenatos às amostras, em becker de 1 L, com 5 organismos cada, por 48 horas [36]. O efeito observado será a imobilidade. Também será realizado o teste de reprodução, com duração de 21 dias de exposição às substâncias, com avaliação do número total de organismos gerados e o seu respectivo sexo [36].

Todas as análises serão conduzidas em triplicata.

O presente projeto espera gerar informação sobre os riscos ambientais decorrentes do uso de fármacos ne bovinocultura leiteira, tanto para indução artificial da lactação, como para controle do carrapato.

O aparato utilizado como reator biológico (Anexo 1) será alvo de patente de modelo de utilidade.

Os resultados deverão gerar uma tese de doutorado e publicações em periódicos científicos