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O presente projeto visa dar continuidade ao importante trabalho de pesquisa em produção e desenvolvimento de imunobiológico realizado na Universidade Federal de Pelotas. Do ponto de vista de desenvolvimento científico e tecnológico, o projeto será desenvolvido em âmbito universitário com a participação de técnicos altamente capacitados em cooperação com diversos departamentos, tendo responsabilidades docentes para estudantes com o maior espectro de formação acadêmica, desde alunos de graduação até de doutorado. Este projeto também é de extrema importância, pois visa promover a interação universidade com empresa nacional.

Uma cepa BL21 StarTM (DE3) de Escherichia coli previamente transformada com o plasmídeo pAE/LTB/GnRH será selecionada para a expressão da proteína quimérica LTB/GnRH. As células armazenadas em glicerol 80% serão inoculadas em 5 mL de meio LB (Luria Bertani) suplementado com ampicilina 100µg/mL e incubadas por 12 h a 37 °C sob agitação de 150 rpm. O cultivo será centrifugado a 3000 x g por 5 min em temperatura ambiente. O pellet celular será suspendido em 25 mL de meio LB suplementado com ampicilina (100µg/mL) e incubado a 37 °C em agitador orbital (150 rpm) por um período de 12 h. O pré-inoculo será adicionado em 475 mL de meio LB suplementado com ampicilina (100µg/mL). O inoculo será incubado 37 °C sob agitação a 150 rpm até o cultivo ter alcançado uma DO600 entre 0,5 e 0,8. Após o cultivo atingir a DO ideal, a expressão será induzida com a adição de isopropil β-D-tiogalactopiranosídeo (IPTG) para uma concentração final de 1mM. O cultivo permanecerá sob agitação de 150 rpm por um período de 3 h a 37 °C.
Após o termino da indução, o cultivo será centrifugado a 15000 x g por 15min (4 °C) e o pellet resultante será suspendido em 20 mL de tampão de lise (NaH2PO4 0,2M; NaCl 0,5M; Imidazole 10mM) com 20 µL de lisozima (100 mg/µL) e incubado por 2 h a 4 °C. Após a incubação, a amostra passará pelo processo de sonicação para o rompimento das células, no qual serão realizados 30 ciclos de 15 s. O processo de centrifugação será realizado como descrito anteriormente. O pellet resultante será suspenso em tampão de solubilização (NaH2PO4 0,2M; NaCl 0,5M; Imidazole 10mM; Ureia 8M) e incubado a 4 °C por 24h. A amostra será submetida a uma etapa de diálise em tampão PBS (pH 7,4) com concentrações decrescentes de ureia. A diálise será realizada durante 3 dias com troca de tampão a cada 12h. A LTB/GnRH presente na amostra será purificada através da cromatografia de afinidade pela presença de uma tag de 6 histidinas na proteína recombinante.
Para análise da expressão, uma amostra proveniente da purificação será coletada e será adicionada ao tampão de amostra para eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE). As amostras serão submetidas à técnica de SDS-PAGE em gel de poliacrilamida 10%. A antigenicidade da LTB/GnRH será avaliada mediante Western blot. Os seguintes soros policlonais serão utilizados: soro de coelhos anti-CT (Sigma-Aldrich) e soro de coelhos imunizados com vacina anti-GnRH comercial. A técnica de SDS-PAGE 10% será realizada contendo o marcador de peso molecular (Marcador Protein Mixture GE Healthcare - 17044601) e a quimera LTB/GnRH. A técnica de Western blot será realizada conforme descrito anteriormente.

 Produzir as proteínas recombinantes com base na plataforma proposta;
 Transferir a proteína produzida para a empresa MERCK SHARP & DOHME SAÚDE ANIMAL LTDA o material produzido para a utilização em testes em modelos animais.