Nome do Projeto
Produção do antígeno recombinante LTB/GnRH na plataforma de expressão Escherichia coli para utilização como imunocontraceptivo em Suínos
Ênfase
Pesquisa
Data inicial - Data final
02/12/2021 - 02/12/2023
Unidade de Origem
Coordenador Atual
Área CNPq
Ciências Biológicas
Resumo
A Universidade Federal de Pelotas através da Fundação Delfim Mendes Silveira em conjunto com a empresa MERCK SHARP & DOHME SAÚDE ANIMAL LTDA tem como objetivo uma proposta de produção de imunobiológico para ser utilizado na imunocontracepção de suínos. Sendo essa, disposta na forma de proposta de transferência do material: antígeno recombinante LTB/GnRH expresso e purificado para a empresa MERCK SHARP & DOHME SAÚDE ANIMAL LTDA.

Objetivo Geral

Expressão do antígeno recombinante LTB/GnRH na plataforma Escherichia coli.

Justificativa

O presente projeto visa dar continuidade ao importante trabalho de pesquisa em produção e desenvolvimento de imunobiológico realizado na Universidade Federal de Pelotas. Do ponto de vista de desenvolvimento científico e tecnológico, o projeto será desenvolvido em âmbito universitário com a participação de técnicos altamente capacitados em cooperação com diversos departamentos, tendo responsabilidades docentes para estudantes com o maior espectro de formação acadêmica, desde alunos de graduação até de doutorado. Este projeto também é de extrema importância, pois visa promover a interação universidade com empresa nacional.

Metodologia

Uma cepa BL21 StarTM (DE3) de Escherichia coli previamente transformada com o plasmídeo pAE/LTB/GnRH será selecionada para a expressão da proteína quimérica LTB/GnRH. As células armazenadas em glicerol 80% serão inoculadas em 5 mL de meio LB (Luria Bertani) suplementado com ampicilina 100µg/mL e incubadas por 12 h a 37 °C sob agitação de 150 rpm. O cultivo será centrifugado a 3000 x g por 5 min em temperatura ambiente. O pellet celular será suspendido em 25 mL de meio LB suplementado com ampicilina (100µg/mL) e incubado a 37 °C em agitador orbital (150 rpm) por um período de 12 h. O pré-inoculo será adicionado em 475 mL de meio LB suplementado com ampicilina (100µg/mL). O inoculo será incubado 37 °C sob agitação a 150 rpm até o cultivo ter alcançado uma DO600 entre 0,5 e 0,8. Após o cultivo atingir a DO ideal, a expressão será induzida com a adição de isopropil β-D-tiogalactopiranosídeo (IPTG) para uma concentração final de 1mM. O cultivo permanecerá sob agitação de 150 rpm por um período de 3 h a 37 °C.
Após o termino da indução, o cultivo será centrifugado a 15000 x g por 15min (4 °C) e o pellet resultante será suspendido em 20 mL de tampão de lise (NaH2PO4 0,2M; NaCl 0,5M; Imidazole 10mM) com 20 µL de lisozima (100 mg/µL) e incubado por 2 h a 4 °C. Após a incubação, a amostra passará pelo processo de sonicação para o rompimento das células, no qual serão realizados 30 ciclos de 15 s. O processo de centrifugação será realizado como descrito anteriormente. O pellet resultante será suspenso em tampão de solubilização (NaH2PO4 0,2M; NaCl 0,5M; Imidazole 10mM; Ureia 8M) e incubado a 4 °C por 24h. A amostra será submetida a uma etapa de diálise em tampão PBS (pH 7,4) com concentrações decrescentes de ureia. A diálise será realizada durante 3 dias com troca de tampão a cada 12h. A LTB/GnRH presente na amostra será purificada através da cromatografia de afinidade pela presença de uma tag de 6 histidinas na proteína recombinante.
Para análise da expressão, uma amostra proveniente da purificação será coletada e será adicionada ao tampão de amostra para eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE). As amostras serão submetidas à técnica de SDS-PAGE em gel de poliacrilamida 10%. A antigenicidade da LTB/GnRH será avaliada mediante Western blot. Os seguintes soros policlonais serão utilizados: soro de coelhos anti-CT (Sigma-Aldrich) e soro de coelhos imunizados com vacina anti-GnRH comercial. A técnica de SDS-PAGE 10% será realizada contendo o marcador de peso molecular (Marcador Protein Mixture GE Healthcare - 17044601) e a quimera LTB/GnRH. A técnica de Western blot será realizada conforme descrito anteriormente.

Indicadores, Metas e Resultados

 Produzir as proteínas recombinantes com base na plataforma proposta;
 Transferir a proteína produzida para a empresa MERCK SHARP & DOHME SAÚDE ANIMAL LTDA o material produzido para a utilização em testes em modelos animais.

Equipe do Projeto

NomeCH SemanalData inicialData final
FABIO PEREIRA LEIVAS LEITE1
NEIDA LUCIA CONRAD
RENAN EUGÊNIO ARAUJO PIRAINE
VITÓRIA SEQUEIRA GONÇALVES

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