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O Bacillus toyonensis é uma bactéria Gram positiva, com capacidade de esporular, não patogênica e tem sido utilizada nas últimas décadas como probiótico na suplementação animal (Gil-Turnes et. al., 2004). A administração de B. toyonensis induz efeitos imunomoduladores com a capacidade de aumentar a eficácia das vacinas em ovinos, camundongos (Roos et. al., 2010) (Santos et. al., 2018), cães (Franz et. al., 2021) e suínos (Kantas et. al., 2014).
A Adenite equina é uma enfermidade causada pelo Streptococcus equi subespécie equi, é uma bactéria Gram positiva, do grupo C de Lancefield, beta hemolítica que causa infecção no trato respiratório superior, sendo altamente contagiosa em cavalos, causando grandes prejuízos na criação de equinos (Boyle, A. G., 2016). Segundo Webb et. al., 2013, o agente etiológico do garrotilho é responsável por quase 30% de todas as infecções equinas relatadas no mundo inteiro. A profilaxia da doença alcançada pelas vacinas existentes no mercado brasileiro é de apenas 50%, por isso a necessidade de novas pesquisas que consigam amplificar essa proteção (Maciel et. al., 2017) Estudos realizados com vacinas inativas de “garrotilho” devem conter um imunomodulador para aumentar a imunogenicidade (Neustroev et. al., 2020). Segundo Sweeney, 1993, os baixos índices de proteção podem estar ligados à inadequação da estimulação antigênica e/ou a curta duração dos anticorpos no soro, ou ainda, pela proteção ser mediada por imunoglobulinas secretoras locais e não por anticorpos séricos. As vacinas que geram imunidade estéril e respostas de anticorpos séricos distinguíveis daquelas induzidas por infecção (DIVA) são necessárias com urgência. Infelizmente, pouco se sabe sobre os imunógenos protetores envolvidos e como eles devem ser apresentados no cavalo para induzir um alto nível de imunidade protetora. Mais pesquisas nesta área são necessárias para melhorar a eficácia das vacinas emergentes (Boyle, A.G. et.al., 2018).

A cepa será adquirida do estoque do laboratório de microbiologia, no Centro de biotecnologia da UFPel, do estoque será semeado em BHI(Brain Heart Infusion), 24h de incubação à 37 °C, de 1-2 colônias foi feito o pré-inóculo em um Erlenmeyer de 500mL, com 50 ml de BHI, 24 h no agitador orbital à 37 °C, 150rpm, e será realizado coloração de Gram para a certificação da pureza para ser realizado o inóculo em Erlenmeyer de 2 litros com 500mL de NYSM, no agitador orbital à 37 °C, 150rpm, por 120 horas. Após este período será observada a presença de esporulação ao microscópio e realização da coloração de Wirtz-Conklin e, para avaliar a pureza do cultivo, será realizada a coloração de Gram. Logo após, o cultivo será centrifugado e suspendido em solução salina para ser realizado um choque térmico de 15min, à 86 °C, com o objetivo de eliminar as células vegetativas e induzir a esporulação.
Produção da vacina contra adenite equina
A vacina será preparada utilizando-se como antígenos cinco amostras de S. equi isoladas e pertencentes à bacterioteca do Laboratório de Microbiologia do Departamento de Biotecnologia do Centro de Desenvolvimento Tecnológico (CDTec) da Universidade Federal de Pelotas (UFPEL), sendo coletadas mediante a punção de abscessos em linfonodos retrofaríngeos e/ou swabs nasais de equinos com garrotilho. Para a produção da vacina, as cepas de S. equi serão cultivadas em meio BHI acrescido de 1% de peptona, a 37°C, durante 18 horas. Em seguida as culturas serão centrifugadas, e os sedimentos suspendidos em salina estéril e titulados mediante a técnica de diluições seriadas e semeadura em ágar sangue. Para a elaboração da vacina, suspensões bacterianas contendo~2,5 × 108 UFC/mL de culturas de cada cepa serão inativadas por formol (1:5.000), adsorvidas em hidróxido de alumínio a 10% como adjuvante e armazenadas em refrigeração até sua utilização.
Grupo de animais experimental
Serão utilizados 40 equinos adultos hígidos, de 3 a 12 anos, do Centro de Ensino e Experimentação em Equinocultura da Palma (CEEEP) – UFPel- Capão do Leão- RS, devidamente desverminados, com acesso à agua ad libitum, racionados com 4kg de ração e __Kg de feno. Os cavalos serão vacinados com 3 mL da bacterina, via intramuscular, contra adenite equina, sendo a primeira dose dia 7 do experimento e a segunda dose 21 dias após(dia 27 do experimento). Os cavalos serão divididos em 4 grupos, cada um com 10 animais.

No grupo 1, Grupo A (azul): inicia a suplementação com o B. toyonensis 30-40mL de esporos 1x108 , intra oral, pistola automática com bico, no dia 0;

Grupo B (verde): inicia a suplementação com o B. toyonensis 4g de esporos 1x108 , via oral, misturados à ração, no dia 0;
Grupo C (vermelho): inicia a suplementação com o B. toyonensis 30-40mL de esporos 1x108 , intra oral, com pistola automática com bico, no quarto dia;
Grupo D (laranja): grupo controle
Quanto às coletas de sangue para avaliações posteriores, serão coletadas amostras por venopunção da jugular coleta de 10mL de sangue, em tubos estéreis´, como pode ser observado no esquema proposto acima onde diz sg. Já nos dias que simbolizados por sg circulado haverá a coleta de 10ml, por venopunção da jugular, em tubos estéreis mais a coleta de 40mL de sangue, por venopunção da jugular, em tubos contendo citrato de sódio;


Avaliação dos níveis totais de imunoglobulinas G
A avaliação dos níveis de IgG totais será realizada através do ensaio imunoenzimático (ELISA) indireto. Placas de poliestireno com 96 cavidades serão sensibilizadas com 50 μL do Streptococcus equi subespécie equi inativado diluído em tampão carbonato-bicarbonato pH 9,6. As amostras de soro serão diluídas em série na base dois iniciando-se em 1:60 até a diluição de 1:61440, em solução salina fosfatada pH 7,6 contendo Tween 20 a 0,05 % (PBS-T). Será utilizado o conjugado de imunoglobulina de coelho, anti–horse IgG conjugada com peroxidase 7 diluído 1/4000 em PBS-T. Resumidamente as placas serão sensibilizadas com o antígeno por 18 h a 4 ºC, sendo que após serão realizadas três lavagens com PBS-T pH 7,6 e a placa será incubada por 60 min a 37 °C com 50 μl de soro de cada equino (em duplicata). Na sequência, a placa será novamente lavada três vezes com PBS-T e então, será adicionado 50 μl do conjugado diluído em PBS-T incubando-se por mais 90 min a 37 °C. Por fim, a placa passará por mais cinco lavagens com PBS-T e em seguida será adicionado 50 μl de substrato/cromógeno, para acontecer a reação em temperatura ambiente por 15 min na ausência de luz. As absorbâncias serão aferidas em um leitor de microplacas TP-Reader8 a 492 nm.

Cultivo de células mononucleares do sangue periférico e extração de RNA
Serão coletados 20 mL de sangue periférico de equinos sadios em tubos contendo o anticoagulante EDTA, o qual será diluído com igual parte de meio RPMI 1640.9 O sangue diluído será sobreposto em igual volume de Histopaque®10 e para uma centrifugação de 30 min a 500 x g. Se obterá uma banda celular, que será transferida para outro tubo de ensaio e lavada por três vezes em RPMI 1640. As células serão ressuspendidas na concentração de 5x107 células/mL em RPMI 1640 contendo 20 % de soro fetal bovino e serão plantadas em placas de 96 cavidades, sendo incubadas por 2 h a 37 °C em atmosfera de 5 % de CO2. Na sequência, serão adicionados separadamente os seguintes estímulos na cultura de células: 10μg/mL de concanavalina A (ConA)7, RPMI 1640, 5 μg/mL de DNA de B. toyonensis, 106 células vegetativas de B. toyonensis e 106 esporos de B. toyonensis. A ConA e o RPMI 1640 servirão como controle positivo e negativo, respectivamente. Passado o período de incubação, haverá o descarte do sobrenadante e as células serão coletadas em TRIzol® reagente. O RNA das células estimuladas será extraído pelo método TRIzol de acordo com as instruções do fabricante.

Síntese de cDNA e Real Time PCR
Serão utilizados 400 ng de RNA para a síntese de cDNA, a reação será realizada conforme as instruções do kit High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit13. As reações da Real time PCR serão realizadas com 1μL de cDNA, 5 μL de GoTaq® qPCR14, 0,25 decada oligômero iniciador e 3,5μL água livre de RNAse, sendo realizada na plataforma STRATAGENE M×3005P® real-time PCR system15. Serão analisadas as quantidades de transcritos de mRNA das citocinas IL-4, IL-17 e IFN-γ, onde o GAPDH será utilizado como gene de referência. Todas as amostras serão analisadas em duplicata. A partir dos valores de Threshold Cycle (Ct) obtidos, será calculada a transcrição relativa dos genes pela comparação com a expressão do GAPDH, de acordo com o método 2-∆∆CT.

• Aumento da resposta imune humoral e celular nos equinos suplementados com probióticos quando comparados aos não suplementados;
• Entendimento sobre mecanismos de ação dos probióticos na modulação da resposta imune
• Subsídio de informações para estudos futuros que visem testar o emprego de probióticos como moduladores da resposta imune vacinal;
• Trabalhos completos publicados em eventos nacionais e internacionais;
• Publicação de trabalhos em periódicos internacionais de alto impacto.