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A equinocultura no Brasil, se destaca como um exponencial setor de pesquisa e inovação no que diz respeito as biotécnicas aplicadas a reprodução equina (GOMES et al., 2013). No entanto, é fundamental o desenvolvimento de tecnologias que ampliem o estudo sobre a perpetuação de indivíduos com relevância zootécnica (CARMO et al., 2002), em especial nas fêmeas. A reserva ovariana é uma rica fonte de gametas finitos (folículos primordiais) que estão disponíveis durante a vida reprodutiva da fêmea (ALVES et al., 2018). Além da relevância da equinocultura em termos regionais, nacionais e internacionais, a espécie equina tornou-se um modelo atraente para diversos estudos comparativos de avaliação de mecanismos fisiológicos críticos envolvidos na foliculogênese (GINTHER et al., 2004; ALVES et al., 2018; GASTAL et al., 2018). No entanto, o ovário equino possui uma arquitetura diferente devido ao rearranjo das zonas cortical e medular (WALT et al., 1979; GINTHER, 1992). E desta forma, se torna imprescindível para a eficiência das técnicas de manipulação ovariana realizar uma avaliação histológica que garanta a qualidade morfológica do folículo pré-antral e preserve a morfologia do tecido folicular e estromal (AGUIAR et al., 2020; GASTAL et al., 2020). Na literatura, não há um consenso sobre qual é a melhor solução fixadora para tecido ovariano equino em relação a diferentes tempos de exposição para um tamanho de tecido padrão, que seja capaz de preservar a qualidade morfológica folicular pré-antral, e as características do tecido ovariano como a densidade de células foliculares e estromais (GASTAL et al., 2020). A espécie equina possui inúmeras particularidades fisiológicas além de sistema de criações sistematicamente mais intensivos que levam a ocorrência de enfermidades. Resultando em várias afecções principalmente relacionadas ao sistema digestório, como as síndromes cólicas e endotoxemia (GONÇALVES et al., 2002). Além disso, algumas alterações endócrinas e de metabolismo podem acarretar síndromes clínicas como a laminite (BELKNAP; PARKS, 2011; SILVA et al., 2013), que em sua forma crônica podem resultar em decúbito, agravamento do quadro, e por fim, o óbito (SWANSON, 1999; HUNT; WHARTON, 2010). Com o intuito de preservar a fertilidade e auxiliar na perpetuação de indivíduos de importância zootecnica, a manipulação de folículos pré-antrais inclusos em tecido ovarino é uma metodologia promissora, com potencial aplicação em tecnologias de reprodução assistida (AGUIAR et al., 2020) e criopreservação tecidual (COMIZZOLI; WILDT, 2014).
O presente estudo tem como objetivo aprimorar as técnicas de manipulação ovariana e metodologias de avaliação da viabilidade folicular, visando auxiliar na perpetuação de indivíduos com importância zootécnica nas diversas raças de equinos. Desta forma, utilizaremos técnicas de manipulação de folículos pré-antrais inclusos em tecido ovariano, que é uma metodologia promissora com potencial aplicação em tecnologias de reprodução assistida e criopreservação de tecido ovariano na espécie equina.

O presente estudo será realizado no Setor de Equinos do Hospital de Clínicas Veterinária (HCV), situado no Campus Capão do Leão, o qual pertence a Universidade Federal de Pelotas (UFPel). O processamento histológico das amostras será realizado no Laboratório de Histologia do Instituto de Ciências Biológicas, situado na Universidade Federal do Rio Grande (FURG) e avaliação morfológica e de viabilidade em parceria com o Instituto Federal da Paraíba - IFPB, Campus Souza e University of Southern Illinois - Carbondale/EUA.
Para o Experimento 1 serão utilizadas 06 éguas provenientes do Centro Experimentação em Equinocultura da Palma (CEEP) - UFPel. As quais serão submetidas a Ovariectomia unilateral por laparotomia de flanco.
Para o Experimento 2 os fragmentos ovarianos serão colhidos pós-morte. Esses fragmentos serão colhidos de éguas que venham a óbito devido a enfermidades clínicas sistêmicas de caráter terminal (síndrome cólica, laminite, sepse e endotoxemia) que estejam internadas no Hospital de Clínicas Veterinárias (HCV) da Universidade Federal de Pelotas. Após autorização dos respectivos tutores responsáveis (Ficha de autorização em anexo).

1. Experimento 1:

1.1. Ovariectomia unilateral
O procedimento de ovariectomia será realizado por laparotomia de flanco unilateral para a retirada de um único ovário (Loesch & Rodgerson, 2003). A ovariectomia por laparotomia de flanco será realizada com a égua em estação evitando a necessidade de anestesia geral (Loesch e Rodgerson, 2003; Emberson, 2012). No procedimento de flanco em pé, a égua será contida e mantida sedada com injeções em bolus ou um sedativo de infusão de taxa constante (Loesch e Rodgerson, 2003). A anestesia local será realizada com bloqueio em L invertido e a área cirúrgica será preparada assepticamente (Loesch e Rodgerson, 2003). Será realizada uma incisão entre a última costela e a face cranial do tubérculo coxal na fossa paralombar (Loesch e Rodgerson, 2003; Rakestraw e Hardy, 2012). O músculo oblíquo externo será incisado e os músculos oblíquo interno e transverso do abdome são separados por dissecção com o dedo (Loesch e Rodgerson, 2003; Rakestraw e Hardy, 2012). A cavidade peritoneal será acessada, uma mão é introduzida para identificar o ovário, tracionado até a incisão e isolado (Loesch e Rodgerson, 2003; Emberson, 2012). O anestésico tópico é injetado no mesovário, sutura absorvível (nº 2) pode ser usada para ligar o pedículo e o ovário será seccionado e removido (Loesch e Rodgerson, 2003; Emberson, 2012).

1.2. Processamento dos Ovários

Posteriormente no laboratório, cada ovário será submetido a retirada do tecido adiposo e ligamentos circundantes, as amostras de tecido cortical ovariano (tamanho aproximado, 3 mm × 3 mm × 1 mm) serão obtidas do ovário com o auxílio de uma pinça sem dente e bisturi. As amostras corticais serão recuperadas evitando áreas adjacentes a um corpo lúteo e folículo pré-ovulatório. A porção cortical será fracionado em 30 fragmentos de tamanho de cultura in vitro (3 mm x 3 mm x 1 mm) para utilização nas avaliações subsequentes.

1.3. Avaliação dos protocolos de fixação

Para avaliação dos fixadores e tempo de exposição 20 fragmentos corticais serão distribuídos randomicamente em cinco tratamentos (4 fragmentos por grupo), com diferentes fixadores e tempos de fixação, verificando-se os seguintes grupos: 1) Controle (Sem fixador, processado a fresco); 2) Carnoy 6 hrs; 3) Carnoy 12 hrs; 4) Paraformaldeído (PAF) 4% 6 hrs e 5) PAF 4% 12 hrs. Posteriormente ao tempo de fixação, os fragmentos passarão por processamento histológico e serão avaliados quanto a qualidade morfológica dos folículos pré-antrais, o número e a classe folicular, a densidade de células foliculares e estromais por fragmento de tecido ovariano. O grupo controle (sem fixador), será imediatamente submetido ao processamento histológico. Os fragmentos ovarianos serão desidratados pelo uso de uma série graduada de álcool, incluídos em cera de parafina e cortados em seções seriais de 7 µm. As amostras serão coradas com ácido periódico-Schiff (PAS) e contrastadas com hematoxilina e eosina (HE).
O protocolo de fixação que apresentar os melhores resultados nas avaliações descritas nos itens 1.3.1 (Microscopia e avaliações foliculares) e 1.3.2 (Avaliação da densidade folicular e estromal) será utilizado para a fixação dos fragmentos ovarianos proveniente das éguas que venham a óbito devido a enfermidades clínicas sistêmicas de caráter terminal no HCV-UFPel.
Assim como, bloco parafinados provenientes desse protocolo de fixação eleito, serão utilizados para posterior análise Imuno-histoquímica descrita no item 1.5 da metodologia.

1.3.1. Microscopia e avaliações foliculares
As lâminas histológicas serão analisadas em microscopia óptica (Nikon, Tóquio, Japão) com aumento de 400x para a avaliação histológica e a classificação dos folículos. A classificação folicular será realizada de acordo com o estágio de desenvolvimento, avaliando a forma e número de camadas de células da granulosa ao redor do oócito (MACIEL et al., 2004). São classificados como primordiais os folículos que possuem oócitos com uma camada de células pré-granulosa achatadas; transicional os que possuem oócito com uma camada de células da granulosa achatada e cuboidal; Primários os que possuem oócito com uma camada de células da granulosa cuboidal e Secundários os que possuem oócitos com duas ou mais camadas de células da granulosa cuboidal. Apenas folículos pré-antrais com núcleo de oócito visualizado serão contados e classificados morfologicamente como normais (folículo contendo um oócito intacto e células da granulosa bem-organizadas sem núcleo picnótico) ou anormais (oócito com núcleo picnótico, citoplasma retraído ou camadas de células da granulosa desorganizadas) (HAAG et al. 2013b). As análises serão realizadas por apenas um operador, que desconheça os tratamentos. No entanto, cinco outros ajudantes treinados, também cegos para os tratamentos, auxiliarão na busca de folículos pré-antrais nas seções histológicas de cada fragmento.

1.3.2. Avaliação da densidade folicular e estromal
Para a avaliação da densidade folicular pré-antral, o perímetro dos cortes histológicos será calibrado em um programa de edição de fotos (Adobe Photoshop CS4, San Jose, EUA) e a medida da área (cm2) será registrada. Então, a densidade folicular será determinada pela seguinte fórmula:
Densidade folicular = número de folículos pré-antrais / área da secção ovariana (cm2).
A densidade celular do estroma ovariano será avaliada conforme descrito por Commin et al. (2012). Resumidamente, um total de 10% dos cortes histológicos para cada fragmento ovariano serão analisados. Quatro campos aleatórios (50 × 50 μm = 2.500 μm2) serão selecionados e os núcleos das células estromais serão contados para calcular a média da densidade celular do estroma por fragmento ovariano. Todas as avaliações e medições serão realizadas por um único operador.

1.4. Criopreservação por vitrificação
Serão utilizados 05 fragmentos corticais para o experimento de criopreservação, pelo protocolo de vitrificação de acordo com Gastal et.al, 2017.
Os fragmentos ovarianos serão colocados em placas de petri contendo as seguintes soluções e períodos de equilíbrio: 1º passo: CPA 0,3 M (DMSO, EG ou PROH) e trealose 0,5 M no meio base (α-MEM + Hepes 2,5 mM + 6 % FES) por 3 min em temperatura ambiente; 2ª etapa: CPA 1,5 M (DMSO, EG ou PROH) em meio básico por 1 min à temperatura ambiente; e 3º passo: CPA 3 M (DMSO, EG ou PROH) em meio básico durante 1 min à TA. Os fragmentos serão levemente secos, colocados em criotubos (1 ml), mergulhados em nitrogênio líquido e armazenados por 1 semana.
Para o processo de descongelamento, os criotubos serão expostos à TA por 30 segundos e, em seguida, imersos em água a 37ºC por 1 min. Imediatamente, os fragmentos serão submetidos a concentrações decrescentes de sacarose (0,5, 0,25 e 0 M no meio base) por 5 min em cada solução para remoção da solução crioprotetora.

1.5. Análise Imuno-histoquímica

Após a preparação das lâminas histológicas contendo as amostras, as mesmas serão desparafinizadas em um vaporizador com tampão de citrato de sódio por 30 minutos para a recuperação de antígenos, e posteriormente, o processo de permeabilização será empregue com Triton X ‐ 100 a 1% por 30 minutos. Os locais de ligação não específicos serão bloqueados com solução de BSA a 1% por aproximadamente 60 minutos, em seguida, os cortes histológicos ficarão incubados durante 60 minutos com anticorpos primários específicos diluídos (1:100). Por fim, as secções serão incubadas no escuro por 60 minutos com o anticorpo secundário de cabra anti-coelho isotiocianato conjugado com fluoresceína (diluição 1: 200). Entre todas as etapas, as secções serão lavadas três vezes com phosfate buffer saline (PBS). Será realizada uma análise minuciosa quanto aos anticorpos que serão utilizados durante o experimento (AMH, IGF-1, Aromatase, Leptina, Apoptose, Viabilidade de membrana e ROS) para reduzir a probabilidade de falhas.

2. Experimento 2:
Éguas que venham a óbito devido a enfermidades clínicas sistêmicas de caráter terminal internadas no Hospital de Clínicas Veterinária farão parte do Experimento 2. Serão utilizadas somente éguas que os tutores responsáveis assinem um termo de doação dos ovários para a pesquisa, conforme formulário Anexo no Processo.
Posteriormente a recuperação do ovário, este será seccionado, e um hemi-ovario será fragmentado em 24 fragmentos de tamanho de cultura in vitro (3 mm x 3 mm x 1 mm). Um subgrupo com 12 fragmentos será avaliado quanto a expressão gênica no tecido ovariano e o restante após o processo de fixação (determinado no Experimento 1) serão avaliados com imuno-histoquímica (IGF-1, Aromatase, Leptina), histologia (Avaliação e classificação de folículos pré-antrais).
No outro subgrupo contendo 12 fragmentos, será realizado o protocolo de criopreservação descrito por Gastal et al. (2017), as amostras ser

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