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O produto é inovador, pois não há no mercado produtos para prevenção de hipocalcemia em vacas de leite com liberação lenta e controlada utilizando um precursor da serotonina endógena. Sendo o cálcio um dos minerais mais abundantes na vaca leiteira, a sua demanda varia bastante durante o período de transição (três semanas antes e depois do parto), anterior ao parto o requerimento fica em torno de 50 g/dia, isto devido, principalmente, ao desenvolvimento final do feto e da produção de colostro. Já após o parto, a quantidade pode chagar a 150g/dia, os quais são principalmente direcionados para a produção de colostro e leite, a quantidade excretada é cerca de 2,1 g/L e 1,1 g/L respectivamente (Goff, 2014). Todo esse requerimento chega a ultrapassar até 7 a 10 vezes a quantidade de cálcio ionizado disponível nos fluidos extracelulares, comprometendo diversas funções biológicas (Horst et al., 2005), acarretando na queda exacerbada dos níveis cálcio, causando a hipocalcemia, sendo que o equilíbrio do cálcio pode demorar em torno de 72 horas para voltarem aos seus níveis normais, prejudicando a vida produtiva e reprodutiva da vaca leiteira. O equilíbrio do cálcio é regulado por principalmente por três hormônios, o paratormônio (PTH), a vitamina D (1,25(OH)2D) e a calcitonina (Goff, 2014).
Uma proteína importante para o metabolismo do cálcio é a proteína relacionada ao paratormônio (PTHrP). Ela apresenta homologia com o paratormônio na porção N-terminal, apresentando 9 resíduos de aminoácidos idênticos na sequência 1-13 (Schluter, 1999). Essa similaridade permite que a PTHrP possa se ligar ao receptor de paratormônio 1 (PTHR1), podendo ativar indiretamente os osteoclastos via osteoblasto (Teitelbaum, 2000), atuando de forma similar ao PTH. Entretanto, diferente do PTH, essa proteína é sintetizada em diversos tecidos, como por exemplo, a pele, os ossos, células epiteliais da glândula mamária entre outros (Datta e Abou-Samra, 2009; Laporta et al., 2014).
Estudos recentes demonstraram a importância da serotonina (5-hidroxitriptamina; 5-HT), de fontes não neurais, na homeostasia do cálcio. A 5-HT é uma monoamina, sendo sua produção iniciada pela conversão do L-triptofano, pela triptofano hidroxilase 1, para 5-hidroxi-L-triptofano (5-HTP), e este é convertido à 5-HT pela L-aminoácido decarboxilase aromático (Laporta et al., 2014) sendo que grande parte da sua produção deriva das glândulas mamárias (Pai e Horseman, 2008). Durante a lactação é uma das responsáveis pela mantença dos níveis de cálcio, sendo responsável pela diminuição da síntese de osteoblastos e a indução da remodelação óssea pelos osteoclastos, com consequente liberação de cálcio, e também, indiretamente, a secreção da PTHrP pela glândula mamária (Weaver et al., 2016).
A 5-HT também está envolvida com o metabolismo energético, principalmente no metabolismo da glicose e dos ácidos graxos livre. Ele tem a capacidade de induzir a regeneração hepática, secreção de glicose pelo fígado e a liberação de insulina pelo pâncreas. Laporta, J. et al. (2015), demonstrou que em bovinos leiteiros, além do aumento dos níveis de cálcio, a administração do precursor de 5-HT, causou um aumento nos níveis de glicose e ácidos-graxos não esterificados e uma redução nos níveis plasmáticos de β-hidroxibutirato, o que demonstra que há uma melhor utilização dos ácidos graxos livres mobilizados do tecido adiposo, deixando a glicose para ser utilizada em outros tecidos periféricos. Sendo assim, a hipótese do trabalho é que um precursor de serotonina aplicado no pré-parto pode aumentar os níveis de cálcio sérico e melhorar o metabolismo energético no pós-parto. Diante disso, o objetivo, é desenvolver um produto de liberação lenta e controlada de 5-hidroxitriptofano (5-HTP), de dose única, aplicada no pré-parto de vacas leiteiras e verificar a dinâmica mineral e energética no pós-parto desses animais, e este ser passível de transferência tecnológica.
Os protocolos atuais para a prevenção ou tratamento de hipocalcemia em animais de alta produção, envolvem a utilização dos compostos a base de cálcio no pós-parto recente, ou a base de sais aniônicos no pré-parto, que exigem repetidos manejos, o que requerem uma infraestrutura de pessoal e equipamentos que encarece os tratamentos, limitando o acesso a pequenos produtores. Diante disso, é de suma importância que se tenha produtos, com menores manejos e que sejam eficazes, contra esse transtorno que acomete a vaca leiteira. A indústria da saúde animal tem um grande interesse em produtos farmacêuticos de liberação controlada e tem sido muito receptiva às inovações em tecnologias de administração de fármacos em animais de produção, devido a beneficios que inclui aplicações menos frequentes, baixo custo, redução de efeitos colaterais, facilidade de administração e redução do estresse, contribuindo para o bem estar animal.
O aspecto inovador desse produto é conhecido também como “gel inteligente”, pois passa do estado líquido, em temperaturas baixas e gelifica quando em contato com a temperatura corporal, formando o gel que servirá como sistema de liberação lenta e contínua do princípio ativo através da administração subcutânea. O diferencial do nosso produto é o veículo que transporta o princípio ativo, que é um gel ao invés de ser uma solução aquosa como os demais produtos do mercado, proporcionando então uma forma controlada e lenta do princípio ativo que culminará também com menos aplicações e mais tempo de duração. A propriedade de transição do estado de solução-gel é reversível, facilitando a aplicação e distribuição no local.
O nosso público-alvo são, produtores de leite, os quais têm a necessidade em resolver os transtornos que a hipocalcemia traz para o rebanho leiteiro. Já o benefício está no fato dessa enfermidade ser sanada com menos custos, mais efetividade, com menos manejos culminando com menos perdas produtivas diretas e indiretas. Em relação à sustentabilidade econômica e social uma vez que o produto aqui apresentado tende a ser mais barato do que os presentes no mercado, o mesmo trará redução de custos por litros de leite produzido. Com um menor custo de produção este produto favorecer que pequenos e médios produtores se mantenham no meio rural e produzindo leite, atingindo de maneira socioeconômica estas pessoas. Já em relação aos grandes produtores, o produto a ser desenvolvido permitirá maior investimento tecnológico, pois com menos animais acometidos por hipocalcemia não necessidade de aquisição de novos animais para manter ou elevar o nível de produção de leite.
Dentro desta perspectiva, espera-se ainda que os resultados obtidos tenham um impacto econômico e social significativo através da obtenção de um produto com benefícios tanto econômico para a indústria farmacêutica veterinária, pelo valor agregado gerado, quanto para os produtores/criadores, pela possibilidade de acesso às novas tecnologias que, inquestionavelmente, através de ações de extensão trarão melhorias de produtividade, contribuindo para o desenvolvimento do setor como um todo.

O projeto será desenvolvido em parceria da Ignis Animal Science (Startup da proponente) e a Universidade Federal de Pelotas (através de um acordo de cooperação), será vinculado à linha de pesquisa de “Inovação Farmacêutica" do Núcleo de Pesquisa, Ensino e Extensão em Pecuária (NUPEEC), mais especificamente na área de “Desenvolvimento de fármacos” linha de pesquisa em que o tutor Marcio Nunes Corrêa é coordenador. Neste projeto, alunos dos Programas de Pós-Graduação em Biotecnologia, Veterinária, Zootecnia da UFPel; além de alunos de iniciação científica e tecnológica dos cursos de graduação em Medicina Veterinária, Zootecnia, Agronomia e Biotecnologia, serão envolvidos. Todos estes alunos fazem parte da equipe do grupo NUPEEC (wp.ufpel.edu.br/nupeec), sendo estas atividades um importante instrumento para a formação pessoal.

EXPERIMENTO 1
Ensaios in vitro das formulações
O projeto que compõe esta proposta envolve o desenvolvimento de um produto polimérico, biodegradável, para a administração controlada de fármacos. As formulações termo reversíveis são também conhecidas como “géis inteligentes”, pois são soluções poliméricas líquidas à temperatura ambiente que gelificam quando em contato com a temperatura corporal, formando o gel que servirá como sistema de liberação controlada do fármaco. O fato das formulações serem liquidas a temperatura ambiente, favorece o fracionamento de doses para adaptação a qualquer espécie e categoria animal, uma vez que o sistema de liberação controlada só é formado in situ. É válido lembrar que a metodologia aqui descrita diz respeito apenas à estudos de pré-formulação e farmacocinética. A seguir estão descritos os materiais que serão utilizados, bem como as metodologias que serão aplicadas no preparo e na avaliação (in vitro) das formulações:

1) Controle de qualidade de matérias primas
A 5-HTP será adquirida de uma empresa certificada, com pureza superior a 99,0%. A água utilizada será purifica primeiramente por destilação e posterior com o sistema Millipore ultra-pure water (Milford, USA).
Será feita a avaliação in vitro através de verificação macroscópica da consistência e aspectos morfológicos. Para essa verificação será utilizada diversas técnicas que estão descritas na Farmacopeia Brasileira e estrangeiras ou compêndio compatível que contenha informações sobre a substância ativa e/ou adjuvante em estudo (Farmacopéia Brasileira, 1988; British Pharmacopoeia, 2001; The United State Pharmacopoeia, 2000).

2) Testes preliminares
Serão realizados testes com o objetivo de verificar se os insumos possuem as características desejáveis para o produto. Eles devem ser inertes química e farmacologicamente, porém imprescindíveis para a elaboração de uma formulação, objetivando proteger e/ou melhor as propriedades do fármaco. Entretanto, os insumos podem reduzir ou ampliar os efeitos farmacológicos, mostrando a importância de verificar a compatibilidade de todos os componentes da formulação (Rowe et al., 2009).

3) Preparo das formulações
As soluções poliméricas serão preparadas de acordo com o clássico “método a frio” (Schmolka, 1972). Os polímeros (principais e acessórios) serão pesados e adicionados lentamente à em água fria, ficando em hidratação com água de alta pureza na temperatura de 4-8 °C, por 24 horas, até que uma solução límpida seja obtida. Em seguida, quantidades suficientes de da 5-HTP (de acordo com o intervalo de concentração estabelecido no protocolo terapêutico originário) será adicionada através de dois métodos: dispersão da forma sólida ou dissolução prévia para depois ser incorporada à solução polimérica, para obtenção do protótipo para teste com duração de 4 dias, para liberação lenta e controlada do princípio ativo.

4) Ensaios in vitro
Nessa etapa, as formulações desenvolvidas serão submetidas a ensaios laboratoriais, conforme preconizado pelas farmacopéias nacional e/ou internacionais (Farmacopéia Brasileira, 1988; British Pharmacopeia, 2001; The United State Pharmacopeia, 2000). Serão preparados simuladores in vitro, para avaliação das formulações num ambiente semelhante ao que se propõe implantá-lo terapeuticamente e de acordo com a via de administração proposta. A partir disso serão feitos os ajustes necessários, tanto na carga da substância ativa como na concentração dos adjuvantes, processos que serão repetidos inúmeras vezes até encontrarmos as formulações ideais.

4.1) Determinação da temperatura de transição (sol-gel):
A temperatura de transição de fase sol-gel será determinada pelo método de inversão tubo (Garripelli et al., 2010). Alíquotas de 2 mL são transferidas para tubos de 13 mm num banho com água a 4 °C com agitação. A temperatura do banho é aumentada de 2°C em 2°C até completa estabilização das formulações. Quando a solução polimérica parar de fluir sob a inclinação do tubo a 90°, é registrada a temperatura de gelificação ou temperatura de transição sol-gel.

4.2) Ensaio de erosão/dissolução do gel:
O perfil de erosão/dissolução do gel é determinado por gravimetria, em que um frasco de vidro de 13 mm de diâmetro, pesado previamente, contendo um volume conhecido do gel, que é equilibrado a 37°C e coberto por uma solução de tampão fosfato pH 7,4 na condição de não saturação do meio (Sink condition), para servir como meio de liberação para o da 5-HTP. Em seguida são colocados num banho-maria a 37°C sob agitação constante e em intervalos pré-definidos, o meio de liberação de cada tubo é removido, o frasco pesado e a massa do gel erodido/dissolvido é calculada pela diferença de peso do frasco (Zhang et al., 2002) sob agitação constante e em intervalos pré-definidos, o meio de liberação de cada tubo é removido, o frasco pesado e a massa do gel erodido/dissolvido é calculada pela diferença de peso do frasco (Zhang et al., 2002).

4.3) Ensaio de liberação in vitro de da 5-HTP
Conforme a descrição do ensaio de erosão, o meio de liberação retirado dos tubos a cada intervalo de pesagem é submetido a análise da 5-HTP em espectrofotômetro de Ressonância Magnética Nuclear (RMN). Todos os testes serão realizados em triplicata.

4.4) Produção dos “protótipos” de bancada
Estes experimentos possuem o objetivo de reproduzir o comportamento da(s) formulação(ões) quando submetida a sucessivas produções. Para isso, serão fabricados lotes-teste, que passarão novamente pelos ensaios in vitro descritos anteriormente. Essa etapa, que antecede o ScalingUp (aumento de escala), possibilitará avaliar o comportamento da formulação quando submetida a um ciclo produtivo com quantidades maiores de matérias primas, onde os pontos críticos de uma formulação farmacêutica serão observados (Gennaro, 2004).
 
EXPERIMENTO 2

Ensaios in vivo em vacas não gestantes
Após a seleção das formulações, para verificação da eficácia da formulação, serão realizados dois estudos in vivo. O primeiro a fim de verificar a liberação do fármaco e possíveis alterações comportamentais e metabólicas.

1) Instalações
O experimento será realizado em uma unidade experimental da Universidade Federal de Pelotas (Centro Agropecuária da Palma), localizado nas coordenadas 31°48'05.5"S 52°30'59.4"O. O sistema de manejo desses animais é extensivo, onde os animais ficam alojados em campo nativo, tendo água e forragem ad libitum.

2) Seleção dos animais e procedimentos experimentais
Nesta fase serão utilizados animais não gestantes e não lactantes, saudáveis, sem raça definida, sendo estes distribuídos em grupos (n=10) de acordo com o número de formulações que apresentarem os melhores perfis de liberação in vitro de 5-HTP, além de um grupo controle (n=10) que irá receber a formulação polimérica sem a adição do princípio ativo. Todos os grupos receberão as formulações por via subcutânea.

3) Avaliações Clínicas
Durante o período experimental, os animais serão acompanhados por um médico veterinário verificando qualquer alteração comportamental e no local de aplicação. Além disso, serão feitos exames clínicos, avaliando frequência cardíaca e respiratória, movimentos ruminais, temperatura retal, coloração de mucosas e grau de hidratação (Rosemberger, 1993), de hora em hora durante as primeiras 10 horas, e posteriormente nos momentos das coletas sanguíneas.

4) Coletas sanguíneas
Serão realizadas coletas de sangue uma hora antes da aplacação das formulações (hora -1), antes da aplicação (hora 0) e nos momentos 5, 10, 15, 30 e 60 minutos, posterior será coletado de hora em hora até 10 horas (horas 2 a 10), 12, 24, 36, 48, 72, 96 e 120 horas após a aplicação, para verificar o perfil de liberação do fármaco. As coletas serão realizas com o sistema vaccutainer, utilizando tubos sem anticoagulante, fluoreto de potássio (KF). As amostras serão centrifugadas a 2250 x g por 15 minutos a fim de se obter o soro sendo estes armazenados a -20°C até o momento das análises. Também serão coletadas amostras em tubos com EDTA nas horas 0, 6, 12, 24, 48, 72, 96 e 120.

5) Análises Bioquímicas e Hematológicas
O soro coletado será avaliado quanto aos níveis de 5-HTP por Ressonância Magnética Nuclear (RMN), já cálcio, fósforo, glicose, ácidos graxos não-esterificados (AGNEs), β-hidroxibutirato (BHB), γ-glutamil transferase (GGT), aspartato aminotransferase (AST), albumina e magnésio serão mensurados utilizando kits comerciais por espectrofotometria em um analisador bioquímico automático (LabMax Plenno, Labtest Diagnóstica LTDA, Brasil).
As análises hematológicas serão realizada, utilizando sangue total coletado com EDTA, através da técnica de impedância para a avaliação de fase vermelha do sangue e por citometria de fluxo para fase branca, utilizando o contador automático BC-2800 (Mindray, China), além disso, o diferencial de leucócitos será realizado através de esfregaços sanguíneos corados com Panótipo (Laborclin, Brasil) e a leitura feita no microscópio Nikon Eclipse E200 (Nikon, Japão) com um aumento de 1000x. Para a análise de fibrinogênio, será utilizado o método de precipitação por calor (Millar et al., 197

 Realizar revisões bibliográficas constantes - Serão realizadas em bancos de patentes e de periódicos de domínio público, durante toda a execução do projeto
 Realizar Reuniões - Serão realizadas reuniões quinzenais, afim de definição da metodologia, ou até mesmo mudança de algo não previsto
 Consolidar habilidades para graduandos e pós-graduandos - Auxiliar os pós-graduandos responsáveis na seleção dos animais e nas avaliações laboratoriais.
 Desenvolver habilidades tecnológicas específicas para os graduandos e pós-graduandos para ensaios in vitro - Auxiliar no preparo das formulações através das operações unitárias (pesagem de materiais, moagem, mistura etc).
 Visualizar dados da pesquisa - Auxiliar na tabulação e análises dos dados, a fim de identificar e organizar os dados para rodar estatística;
 Produzir 1 dissertação de Mestrado - auxiliando na escrita de discussão dos resultados.
 Publicar, pelo menos, 2 artigos em revistas de circulação nacional ou internacional, classificadas como “A” no “Sistema de Classificação de Periódicos, Anais e Revistas” da CAPES - com o auxílio do pós-graduando serão realizadas discussões e confecções dos manuscritos com prazos estabelecidos, para que sejam publicados durante todo o período do estudo.
 Divulgar os resultados em 3 congressos da área em âmbito internacional, 2 nacionais e 3 regionais; com trabalhos de bolsistas de Iniciação Científica e Tecnológicas e com trabalhos de pós-graduandos.
 Produzir pelo menos 1 patente - auxiliar na confecção da patente junto a coordenação de inovação tecnológica da UFPel
 Produzir um produto passível de transferência tecnológica para área das ciências agrarias, a fim de obter maior visibilidade da Startup, assim como da Universidade, auxiliando assim no aumento da avaliação seu conceito CAPES dos programas envolvidos.