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Atualmente, o Brasil possui aproximadamente 218,2 milhões de cabeças de gado e o uso de biotecnologias reprodutivas, como a sincronização de estro, tem se tornado cada vez mais comum, na rotina dos produtores, por se tratar de uma técnica que aumenta a eficiência reprodutiva dos bovinos de corte e leite. Para sincronização de estro uma das formas farmacêuticas mais utilizadas para administração de Progesterona, são os dispositivos intravaginais. Entretanto, estes dispositivos apresentam desvantagens, como a necessidade de grande manipulação dos animais, além de ser um método mais invasivo, por necessitar permanecer, por aproximadamente, 7 dias no canal vaginal dos animais, o que pode causar desconforto e infecções uterinas. Contudo, este projeto apresenta uma proposta voltada ao desenvolvimento de plataformas farmacêuticas para liberação prolongada de Progesterona, de dose única, na forma injetável, por via subcutânea, para ser utilizada em técnicas reprodutivas, como sincronização de estro. As plataformas permitirão reduzir a manipulação e estresse dos animais, favorecendo o bem-estar animal e ainda maior custo-benefício ao produtor pela simplificação do protocolo e consequente, redução de mão de obra. Além disso, é uma alternativa de veículo farmacêutico sustentável, por se tratar de uma plataforma com composição de origem natural, de alta estabilidade, biodegradável e atóxica.

O projeto que compõe esta proposta envolve o desenvolvimento de duas plataformas farmacêuticas caracterizadas por ser uma emulsão e/ou um gel termosenssível, de alta estabilidade, biodegradável, para a administração prolongada de progesterona. As plataformas poderão ser adaptadas para receber diferentes hormônios, doses e por tanto, serem adaptadas a qualquer espécie e categoria animal. Todas as metodologias adotadas consideram a bibliografia da área e são práticas laboratoriais e de campo, expertise da equipe envolvida nessa proposta (Farmacopéia Brasileira, 1988; British Pharmacopeia, 2001; The United State Pharmacopeia, 2000; Qiu Y, et al., 2001).

Por se tratar de um projeto de inovação, a metodologia e insumos utilizados, não serão descritos, apenas citados:


1.1) Preparo das formulações
Desenvolver pré-formulação de liberação lenta, injetáveis para a administração subcutânea de progestrona;

1.2) Ensaios in vitro
Nessa etapa, as formulações desenvolvidas serão submetidas a ensaios laboratoriais, conforme preconizado pelas farmacopéias nacional e/ou internacionais. Serão preparados simuladores in vitro, para avaliação das formulações num ambiente semelhante ao que se propõe implantá-lo terapeuticamente e de acordo com a via de administração proposta. A partir disso serão feitos os ajustes necessários, tanto na carga da substância ativa como na concentração dos adjuvantes, processos que serão repetidos inúmeras vezes até encontrarmos as formulações ideais.


1.3) Estudo in vivo - Eficácia do sistema de liberação lenta

1.3.1) Aplicabilidade
Será realizado no Centro Agropecuário da Palma, da Universidade Federal de Pelotas, localizada na BR 116, km 537, Capão do Leão. Nesta parte do estudo, será escolhida a melhor formulação categorizada como Emulsão e a melhor categorizada como Gel termosenssível, com base nos resultados dos testes in vitro.
Serão utilizados o total de 4 animais para analisar a seringabilidade e aplicabilidade do produto. Será feito uma aplicação subcutânea da formulação para análise de viabilidade de aplicação. Grupo 1 (n=2) – que receberá uma dose da formulação categorizada por ser uma emulsão e Grupo 2 (n=2) que receberá uma dose da formulação categorizada por ser um gel com intuito de testar a formulação categorizada por ser um gel termosenssível. A coleta de sangue será feita uma vez ao dia, por 9 dias.


1.3.2) Liberação in vivo
Será realizado no Centro Agropecuário da Palma, da Universidade Federal de Pelotas, localizada na BR 116, km 537, Capão do Leão. Nesta parte do estudo, será escolhida a melhor formulação categorizada como Emulsão e a melhor categorizada como Gel termosenssível, com base nos resultados dos testes in vitro e de aplicabilidade. Serão realizados testes para comparação do efeito da nova formulação com os produtos já comercializados. Para isso, serão utilizadas 15 vacas, clinicamente saudáveis, pesando entre 500 e 600 kg. Grupo 1 (n=5) – que receberá uma dose da nova formulação categorizada por ser uma emulsão com P4 e o grupo 2 (n=5) que receberá uma dose da nova formulação caracterizada por ser um gel termosenssível com P4, sendo que as aplicações serão subcutâneas, na tábua do pescoço. O grupo 3 (n=5) – receberá um protocolo padrão, de um produto já comercializado.
Amostras de sangue serão coletadas durante 9 dias, a cada 12h após tratamento. Serão coletadas por punção do complexo arterio-venoso coccígeno através de dois tubos: em tubos com anticoagulante (EDTA), para determinação do hematócrito e um sem anticoagulante (10 mL Vacuplast®) para obtenção do soro. Todas as amostras serão centrifugadas a 1500 xg durante 15 min. O plasma será transferido para tubos de eppendorf, identificados e armazenados a -20ºC até a realização das análises. Serão determinados os teores séricos de progesterona sanguínea através da leitura da amostra no analisador automático de imunoensaios (ACCESS Beckman Coulter). Além disso, também serão realizadas análises bioquímicas através da leitura no analisador bioquímico automático Labmax Plenno (Labtest, MG, Brasil) e hematológicas.

1.4) Análise Estatística
Os dados obtidos destes experimentos serão analisados no programa estatístico SAS (SAS Institute Inc., Cary, EUA). As médias serão analisadas pelo método MIXED MODELS, considerando o animal, o grupo e o momento da coleta. A comparação de médias individuais será feita através do teste de Tukey-Kramer. Médias pontuais serão analisadas pelo método One-way ANOVA. A correlação entre as variáveis será feita pelo coeficiente de correlação de Pearson. Serão considerados significativos valores de P<0,05.

Após o desenvolvimento e comprovação da eficácia da plataforma farmacêutica, serão realizados testes de analíticos, citotoxicidade e de estabilidade.

2) Testes in vitro de viabilidade farmacêutica

2.1) Citotoxicidade das plataformas farmacêuticas (emulsão/Gel)

A linhagem celular será semeada em placa de Petri (15 × 60 mm), no volume de 5 ml e incubada durante 48h a 37°C em atmosfera úmida com 5% de CO2. Após esse período, o meio de cultura será desprezado e adicionado 5 ml do meio “overlay” em cada placa de Petri. No momento do uso, o ágar será fundido e misturado na mesma proporção com o meio mínimo de Eagle (MEM), duas vezes concentrado, ambos a uma temperatura de 44 °C. Fragmentos, com cerca de 0,25cm2 de área superficial dos biomateriais serão colocados sobre o ágar antes de sua solidificação completa (ROGERO, et al., 2002).
As placas de Petri serão incubadas novamente em estufa com 5% CO2 a 37 °C por 24 h. As amostras serão avaliadas em duplicata. Serão utilizados como controle positivo, fragmentos de látex e como controle negativo, discos de papel de filtro. As placas serão analisadas macroscopicamente quanto a presença de halo e microscopicamente quanto a integridade celular ao redor da amostra (ROGERO, et al., 2002).

2.2) Testes de estabilidade da plataforma emulsão/hidrogel sem e com princípio ativo

A estabilidade será acompanhada por um período de 0, 3 e 6 meses (estabilidade acelerada) em condições extremas de temperatura e umidade (50 ± 2°C e UR 90 ± 5 %) (MIRCO e ROCHA, 2020). As formulações com e sem princípio ativo serão avaliadas com relação aos parâmetros físico - químicos (determinação do pH, densidade, viscosidade, volume e características organolépticas) e parâmetros microbiológicos (contagem do número total de micro - organismos mesófilos).

2.3) Testes de analítico da plataforma emulsão/hidrogel sem e com princípio ativo

Será realizada a determinação de pH em pHmetro digital, através da introdução do eletrodo na amostra, procedendo três leituras sucessivas e obtendo a média das leituras, como resultado. Além disso, a determinação da viscosidade será realizada utilizando um viscosímetro (ANVISA, 2019). As características organolépticas do tempo zero, ou seja, logo após o preparo, serão utilizadas como padrão para classificação, de acordo com o nível de alteração (ANVISA, 2004). A determinação do volume será feita utilizando pesagem individual dos frascos com tampa, contendo as formulações com e sem principio ativo. Após a remoção das formulações, se realizará a lavagem, secagem dos frascos e posteriormente, serão pesados novamente. O volume será calculado pela diferença entre o peso do frasco cheio e vazio (ANVISA, 2019). Além disso, será feita a determinação da densidade relativa (formulação com e sem princípio ativo) utilizando picnômetro de vidro com capacidade de 50 ml, previamente limpo e seco.

Indicadores a serem alcançados:
- Depósito de uma patente;
- Publicação de ao menos 1 artigo em periódico de alto fator de impacto;
- Publicação de resumos em congressos nacionais e internacionais da área.

Resultados esperados:
A partir desta proposta, pretende-se desenvolver e testar duas plataformas farmacêuticas de liberação prolongada de Progesterona para utilização em protocolos de sincronização de estro bovino. Manter a liberação de Progesterona, a partir destas plataformas farmacêuticas, por aproximadamente 9 dias.
Ainda, compreender melhor como ocorre o perfil de liberação da Progesterona utilizando as duas plataformas farmacêuticas (emulsão/gel termosenssível).
Ao final do projeto, espera-se ter pelo menos um produto finalizado, testado, eficiente e pronto para o mercado. E assim, gerar impactos econômicos e sociais para o âmbito acadêmico, indústria farmacêutica veterinária e ainda, para os criadores/produtores, com a disponibilização da nova tecnologia de alta qualidade, contribuindo para o desenvolvimento do setor como um todo.