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A laminite há muito tempo vem sendo reconhecida como uma condição dolorosa do casco que causa claudicação em equinos (HEYMERING, 2010) e pode ter efeitos debilitantes a longo prazo como uma condição recorrente ou crônica e, na pior das hipóteses, exige a eutanásia de um animal com dor considerável (HUNT, 1993). Na apresentação clínica, normalmente ocorre claudicação envolvendo um ou mais cascos, mais comumente nos membros torácicos, rigidez, deslocamento de peso, e relutância em movimento, pulsos arteriais digitais aumentados e sensibilidade a pressão aplicada na sola ao pinçamento (DYSON, 2011). Muitos cavalos também apresentam alterações grosseiras na parede do casco que incluem anéis divergentes, hiper crescimento com linha branca aumentada ou separada e sola plana ou convexa.

Historicamente, a “laminite clássica” foi associada a condições graves, como à sepse ou síndrome de resposta inflamatória sistêmica (SIRS), com sobrecarga de amido ou com a indução de metrite usada para criar modelos experimentais (OBEL, 1948). Por outro lado, a laminite do membro de suporte pode resultar de qualquer claudicação unilateral dolorosa com peso anormal prolongado (BAXTER & MORRISON, 2009; VAN EPS et al., 2010; VIRGIN et al., 2011). A década de 1980 viu a publicação das primeiras hipóteses para vincular doença endócrina e laminite, denominado “laminite endocrinopática” (COFFMAN & COLLES, 1983; JEFFCOTT et al., 1986), com resistência à insulina ou sua regulação anormal sendo associada, especialmente em raças de pôneis.

Então, a laminite passou a ser considerada uma síndrome clínica (ao invés de uma doença discreta) que resulta de várias enfermidades sistêmicas ou, com menos frequência, como mencionado acima, pela sobrecarga mecânica compensatória de um indivíduo claudicante (BAXTER & MORRISON, 2009; VAN EPS et al., 2010; VIRGIN et al., 2011; WYLIE et al., 2015). Desde 1948, a laminite foi considerada uma entidade de doença, embora com causa (s) obscura (s) que poderia ser estudada no contexto de SIRS induzida com amido ou oligofrutose, denominados coletivamente por variáveis de excesso de carboidratos (OBEL, 1948; GARNER et al., 1975; GALEY et al., 1991; VAN EPS & POLLITT, 2009). Apesar do reconhecimento da associação entre doença endócrina e laminite, esta conexão foi em grande parte ignorada. Só depois, que a laminite "endocrinopática" foi inequivocadamente induzida em modelo de hiperinsulinemia, é que se tornou claro que a laminite pode ter causa multifatorial (WYLIE et al., 2012).

A disponibilidade do modelo de hiperinsulinemia forneceu uma oportunidade de comparar a patologia do casco com as descrições anteriores com base na laminite associada a SIRS (OBEL, 1948; GARNER et al., 1975; ROBERTS et al., 1980; POLLITT, 1996). Embora doenças associadas a SIRS são frequentemente graves, a doença endócrina é tipicamente crônica, com uma fase subclínica potencialmente prolongada. No entanto, a exploração da histologia da região lamelar, em ambos os cenários revelaram um espectro relativamente conservador de lesões (ASPLIN et al., 2007; DE LAAT et al., 2011b, 2013a; KARIKOSKI et al., 2014, 2015, 2016), possivelmente refletindo uma limitação funcional, plasticidade para este tecido altamente especializado ou semelhanças mecanicistas em sua lesão. Os dados atuais propõem uma fase subclínica variável associada a alterações grosseiras na cápsula do casco, com alongamento das células lamelares, em um evento inicial e fundamental na fisiopatologia (PATTERSON-KANE et al., 2018).

A mudança de paradigma final envolveu mudanças na compreensão da patologia da laminite, com a identificação do estiramento de células lamelares como uma lesão precoce (KARIKOSKI et al., 2014, 2015, 2016). Nesse contexto, a laminite, está entre as mais graves afecções ortopédicas no cavalo, que dependendo do insulto clínico poderá evoluir drasticamente para uma fase crônica (COLLINS et al., 2010; CARTER et al., 2011; ASSIS, 2016), caracterizada pelo afundamento da falange distal ou por diferentes graus de rotação (ASSIS, 2016, LUZ et al., 2021). Portanto, a instabilidade lamelar, alterações circulatórias e biomecânicas presentes nessa condição crônica podem interferir na difusão de nutrientes ao extrato córneo, promovendo, secundariamente, deficiência de microelementos importantes ao processo de queratinização, atrasando a recuperação, renovação e resistência desse tecido (MENDES et al., 2013).

A deficiência de alguns nutrientes como zinco, enxofre, biotina, lisina e metionina proporcionam ocorrência de rachaduras e escamações na parede do casco (ZÚCCARI et al., 2009). Neste contexto, os minerais, substâncias inorgânicas que compõem os alimentos, são de extrema importância para o metabolismo do organismo e são cofatores para diversas enzimas que atuam em processos catalíticos (CINTRA, 2016). Dessa forma, alguns minerais desempenham papel fundamental nutritivo do casco como o cálcio (macromineral), que regula os processos de queratinização e cornificação dos queratinócitos. O cobre (micromineral) tem uma importante função catalítica e relação direta com a respiração e a fosforilação oxidativa (LINDER, 1996). Outro nutriente chave à queratinização é o zinco (SMART; CYMBULAK, 1997; MÜLLING et. al., 1999), pois, assim como o cobre, possui funções catalíticas de diversas enzimas participantes do processo de queratinização como a RNA polimerase, fosfatase alcalina, álcool desidrogenase (TOMLINSON et al., 2004), bem como estrutural e regulatória na atividade da proteína quinase C, que fosforila proteínas importantes para gerar energia para os processos de queratinização (VAN RIET et al., 2013).

Outros microminerais como o ferro, que dentre muitas de suas funções está correlacionado com a vitamina A, está intimamente relacionada com a queratinização de epitélios principalmente dos tratos digestório, respiratório e urinário, além da conjuntiva que reveste os olhos e da regulação das concentrações de queratina na epiderme, informações que levam a crer que a correlação existente entre ferro e vitamina A, mais especificamente seus déficits no organismo, prejudica a renovação celular e revitalização de células localizadas na derme e epiderme, além de ser crucial nos processos de oxigenação celular, e atuar como cofator em vários processos enzimáticos do queratinócito. Em humanos, pesquisadores observaram que a deficiência de vitamina A pode manifestar-se em alterações morfológicas das unhas (CASHMAN et al., 2010).

Macrominerais, como o magnésio e sódio são fundamentais para metabolismo de alguns tecidos, e de alguma forma, participam dos processos catalíticos de formação do tecido epidérmico. O magnésio tem relação direta com o metabolismo do cálcio e do potássio, ou seja, havendo reduções nos níveis de magnésio, diminuem as concentrações de potássio e cálcio pelo aumento da excreção renal desses eletrólitos, visto que o magnésio apresenta influência sobre a bomba de sódio e potássio e canais de cálcio presentes na membrana celular (KASS e POEIRA, 2015). Além disso, o magnésio é um mineral que aumenta as taxas de síntese proteica, visto que o casco é composto basicamente pela proteína queratina, além de colágenos, estruturas relevantes no processo de queratinização do tecido córneo. Na estrutura óssea, esse mineral em combinação com outros íons como de fosfato e cálcio, são depositados na composição formada pelas fibras de colágeno da matriz extracelular, ocorrendo a cristalização e contribuindo assim, à rigidez do tecido (SHAVANDI et al., 2015; GUERREIRO, 2019).

Diante do exposto, especula-se possível desregulação da concentração desses minerais, na fisiologia e formação do tecido queratinizado, que podem levar a mudanças estruturais e consequente comprometimento na saúde e integridade do estojo córneo, devido a severidade da laminite crônica. Contudo, há um empenho científico envolvendo esta enfermidade, para melhor compreender alterações fisiopatológicas (ENGILES et al., 2015; XAVIER et al., 2015, DE LAAT e POLLITT, 2019) e tratamentos (DE SOUZA et al, 2020, RODRIGUES et al., 2020), porém, os danos que esta instabilidade falangeana pode causar nos teores de compostos inorgânicos do casco ainda não foram descritos. Portanto, são necessárias mais investigações relacionadas a concentração de minerais no casco equino, bem como o efeito dos teores destes no casco de indivíduos com laminite crônica.

Todos os animais serão atendidos por médicos veterinários clínicos experientes e a obtenção dos dados será de acordo com manual (anexo 1), identificação, histórico e dados clínicos dos equinos (anexo 2). Serão adquiridas amostras de cascos de equinos hígidos provenientes dos mesmos locais dos animais enfermos no intuito de servirem como o grupo controle.
Animais e delineamento experimental
Para este estudo serão utilizados “20” cavalos previamente diagnosticados com descolamento e rotação e/ou afundamento da falange distal, caracterizando a laminite crônica, tendo como base a posição da linha de estresse do casco pelo menos no terço médio do estojo córneo (figura 1), ou com três ou mais meses em que ocorreu descolamento e rotação e/ou afundamento da falange distal.
Coleta de amostra Casco
Para esse ensaio serão coletadas amostras de dois cascos por animal, um com descolamento e rotação e/ou afundamento da falange distal e outro hígido, onde cada cavalo servirá como seu próprio controle, portanto animais que possuam os quatro membros afetados não serão utilizados neste ensaio. Quando ambos os membros torácicos ou pélvicos apresentarem laminite crônica, as coletas envolverão um casco doente e um hígido ipsilateral, respeitando o mesmo lado do plano sagital referente. As amostras consistirão de 2g (dois gramas) de farelo de tecido córneo, coletadas das regiões lateral, dorsal e medial do estojo córneo. Serão realizadas duas coletas por animal, sendo uma do casco saudável e outra do casco doente. Para a realização das coletas será utilizada grosa (Nicholson© , 14” 350 mm) e com o intuito de evitar a contaminação por minerais presentes no ambiente será feita a limpeza dos cascos com detergente isento de minerais e posteriormente a secagem com álcool absoluto, sendo descartada a porção superficial do casco (SILVA et al., 2020).
Coleta de amostras do Cabelo
As amostras de pelo poderão ser coletadas da crina, cola ou do pelo da região da cernelha. Serão coletadas com auxílio de uma tesoura de aço inoxidável ou de esquila devidamente esterilizada, na qual consistirá em manter o distanciamento de um centímetro (1 cm) da pele (base do fio), preservando quatro centímetros (4 cm) de cabelo e descartando a porção superficial dos fios, obtendo-se dois gramas (2g) dos mesmos, posteriormente encaminhadas ao Laboratório de Metrologia Química da UFPEL (LabMequi) para análise. O material coletado, devidamente identificado, será conservado a temperatura ambiente em tubos Falcon de 50 ml, esterilizados e encaminhados ao Laboratório de Química da UFPel (LabMequi).
Análises
Os teores de cálcio, cobre, zinco, ferro, sódio, magnésio, manganês, enxofre, potássio e fósforo das amostras serão determinados, segundo a metodologia utilizada no Exercício Colaborativo CRM-Agro FT_012016 (2016), com modificações para melhorar a decomposição dos farelos dos cascos. Para todas as análises serão utilizadas técnicas distintas para os específicos elementos. Serão pesados aproximadamente 250 mg de amostra diretamente em tubos de Borosilicato, considerando análise em triplicata. Posteriormente, adiciona-se 5,0 mL de HNO3 65% v v-1 bidestilado, acopla-se o sistema de refluxo aos tubos e se coloca em bloco digestor a 150 °C por duas horas. Após esse período as amostras apresentarão uma coloração marrom intensa, característica da decomposição do material. Para deixar a solução mais límpida, após esfriar, adiciona-se 1,0 mL de H2O2 e leva-se ao bloco digestor por mais 30 minutos na mesma temperatura. Posteriormente, as amostras serão transferidas para frascos de polipropileno e aferidas à 20 mL com água deionizada. Os minerais serão quantificados por espectrometria de emissão óptica com plasma induzido por micro-ondas. Todos os animais com diagnóstico de laminite crônica serão radiografados no (s) membro (s) afetado (s) de acordo com metodologia descrita por ... para uniformizar as imagens adquiridas. Para isso será utilizada, como ponto de referência uma escala métrica com dimensões conhecidas a fim de calibragem do software ImageJ® (GEIGER et al., 2016) com conversão de pixels para centímetros. Em seguida serão realizadas todas as medições de área do padrão venográfico no software referido, sendo a proporcionalidade entre elas expressa em percentuais.

Pretende-se com esse estudo determinar o padrão de mineralização do casco de cavalos hígidos e com laminite crônica, conhecer a correlação entre o déficit vascular e a concentração mineral do casco de equinos com esta devastadora doença, determinar carências e os déficits de minerais no tecido córneo de cavalo com laminite crônica, definindo à necessidade de suplementação mineral exógena, além de orientação de práticas de manejo ou suplementação, gerando tecnologias prontamente disponíveis ao meio de produção equina, a partir dos resultados encontrados.