Nome do Projeto
PESQUISA SOBRE A PRESENÇA DE Toxoplasma gondii, Neospora caninum, Sarcocystis spp. e Trypanossoma spp. EM ÓRGÃOS DE JAVALI (Sus scrofa).
Ênfase
Pesquisa
Data inicial - Data final
01/05/2022 - 30/04/2023
Unidade de Origem
Coordenador Atual
Área CNPq
Ciências Agrárias
Resumo
A presença de zoonoses como a toxoplasmose, neosporose, sarcocistose e trypanossomose em javalis (Sus scrofa) vem sendo estudadas pelos pesquisadores do mundo todo (BENETTI et al., 2009; RACKA et al., 2015; WINTER et al., 2019; MACHADO et al., 2021. Por meio de diagnóstico molecular, baseado em PCR, espera-se identificar se estão, e quais destes protozoários estão, presentes em órgãos de javali, representando ameaças a saúde humana, por serem zoonoses.
Objetivo Geral
O objetivo do estudo consiste em verificar a presença ou ausência de protozoários Toxoplasma gondii, Neospora caninum, Sarcocystis spp. e Trypanossoma spp. em órgãos de javali provenientes de caça autorizada no município de Frederico Westphalen, Rio Grande do Sul.
Justificativa
Visto que os parasitas alvo da pesquisa, são causadores de importantes zoonoses de saúde púbica, torna-se de grande valia identificar o javali (Sus scrofa) como possível portador de tais microrganismos, bem como transmissor destas zoonoses.
Nos últimos anos houve aumento da população de javalis no Brasil, principalmente no Rio Grande do Sul, ocasionando perdas econômicas e prejuízos ao ecossistema local (BRASIL, 2020).
Os javalis (Sus scrofa) podem estar envolvidos no ciclo e disseminação de várias zoonoses e, devido à proximidade filogenética com os suínos domésticos (Sus scrofa domesticus), merecem atenção redobrada quanto à transmissão de microorganismos de importância em saúde animal e humana (MACHADO, 2019).
Nos últimos anos houve aumento da população de javalis no Brasil, principalmente no Rio Grande do Sul, ocasionando perdas econômicas e prejuízos ao ecossistema local (BRASIL, 2020).
Os javalis (Sus scrofa) podem estar envolvidos no ciclo e disseminação de várias zoonoses e, devido à proximidade filogenética com os suínos domésticos (Sus scrofa domesticus), merecem atenção redobrada quanto à transmissão de microorganismos de importância em saúde animal e humana (MACHADO, 2019).
Metodologia
Obtenção de amostras:
Amostras de órgãos de javali serão encaminhadas pelo Laboratório de Microbiologia e Imunologia Veterinária do Instituto Federal Farroupilha (LAMIVET – IFFAR), campus Frederico Westphalen, ao Laboratório de Doenças Parasitárias da Universidade Federal de Santa Maria (LADOPAR – UFSM) para diagnóstico. As amostras serão classificadas e identificadas de acordo com o sexo do animal – macho (M) e fêmea (F) – e com o órgão coletado.
As amostras de tecido serão recebidas já aliquotadas em microtubos de 2 mL, armazenadas em caixas de fibra de papel sob congelamento.
Todas serão submetidas à procedimento de extração de DNA com kit comercial Wizard® Genomic DNA Purification Kit - Promega®, com protocolo adaptado segundo Bräunig (2016).
Após a extração, serão realizadas reações de nested PCR para pesquisa de Toxoplasma gondii, Neospora caninum e Sarcocystis spp. Após será feito PCR convencional para pesquisa de Trypanossoma spp., de acordo com Desquesnes (2001).
Extração de DNA:
Serão pesados 20 mg de tecido e adicionado 600 µL de solução de lise de núcleo e homogeneizado por 10 segundos e incuba-se em termobloco ou banho-maria a 65 °C por 15 a 30 minutos. Após, adiciona-se 3 µL de RNase e incuba a 55 °C por 14 a 16 horas.
Adiciona-se 200 µL de solução de precipitação de proteína, passa em vórtex e resfria no congelador por cinco minutos. Centrifuga-se a 16.000 g por quatro minutos, transfere-se o sobrenadante para um tubo contendo 600 µL de isopropanol a temperatura ambiente e homogeneíza por inversão. Centrifugação a 16.000 g por um minuto, remove-se o sobrenadante, adiciona-se 600 µL de etanol 70% em temperatura ambiente e mistura.
Centrifugação a 16.000 g por um minuto, aspira-se o etanol e deixa o pellet secar naturalmente mantendo o tubo aberto por 15 minutos. Então reidrata-se o DNA com 100 µL de solução de hidratação a 65 °C por uma hora.
Nested-PCR:
O mix da primeira reação é composto por 16,5 µL de água ultrapura + 2,5 µL de tampão –MgCl + 0,7 µL de dNTP + 1,25 µL de MgCl2 + 1 µL de primer Tg18S48F + 1 µL de primer Tg18S359R + 2 µL de DNA. O mix da segunda reação é composto por 16,5 µL de água ultrapura + 2,5 µL de tampão –MgCl2 + 0,7 µL de dNTP + 1,25 µL de MgCl2 + 1 µL de primer Tg18S58F + 1 µL de primer Tg18S348R + 2 µL de DNA.
A reação irá amplificar o RNA ribossomal 18S e terá como primers externos Tg18S48F (5’CCATGCATGTCTAAGTATAAGC3’) e Tg18S359R (5’GTTACCCGTCACTGCCAC3’) em sua primeira reação, e na segunda reação se utilizará os primers internos Tg18S58F (5’CTAAGTATAAGCTTTTATACGGC3’) e Tg18S348R (5’TGCCACGGTAGTCCAATAC3’). Tem-se um produto final de 290 pb para Sarcocystis neurona, Neospora caninum, Hammondia hammondi e Toxoplasma gondii e, para Sarcocystis spp., um produto com 310 pb. Como controle positivo se utilizará amostra de Neospora caninum cepa NC1, proveniente de cultivo celular. A reação se dá da seguinte forma: 94 °C por cinco minutos; 45 segundos a 94 °C, 45 segundos a 55 °C e 45 segundos a 72 °C (34x) e cinco minutos a 72 °C. Na eletroforese em gel de agarose utiliza-se um gel a 2% e então visualiza-se o resultado da reação em luz UV.
PCR convencional:
Como descrito por Desquesnes (2001), a reação irá utilizar os primers Kin1F (5’GCGTTCAAAGATTGGGCAAT3’) e Kin2R (5’CGCCCGAAAGTTCACC3’), que amplifica o gene ITS1, presente nas regiões conservadas entre rDNA 18S e 5.8S, com produtos que variam de 350 a 780 pb. Como controle positivo se utilizará amostra de Trypanossoma evansi sequenciada e utilizada como controle positivo no laboratório. A reação inicia com temperatura de 94 °C por três minutos e repete 34x a sequência de 60 segundos a 94 °C, 60 segundos a 53 °C, e 60 segundos a 72 °C, finalizando com cinco minutos a 72 °C. Na eletroforese em gel de agarose utiliza-se um gel a 1,5% e então visualiza-se o resultado da reação em luz UV.
Amostras de órgãos de javali serão encaminhadas pelo Laboratório de Microbiologia e Imunologia Veterinária do Instituto Federal Farroupilha (LAMIVET – IFFAR), campus Frederico Westphalen, ao Laboratório de Doenças Parasitárias da Universidade Federal de Santa Maria (LADOPAR – UFSM) para diagnóstico. As amostras serão classificadas e identificadas de acordo com o sexo do animal – macho (M) e fêmea (F) – e com o órgão coletado.
As amostras de tecido serão recebidas já aliquotadas em microtubos de 2 mL, armazenadas em caixas de fibra de papel sob congelamento.
Todas serão submetidas à procedimento de extração de DNA com kit comercial Wizard® Genomic DNA Purification Kit - Promega®, com protocolo adaptado segundo Bräunig (2016).
Após a extração, serão realizadas reações de nested PCR para pesquisa de Toxoplasma gondii, Neospora caninum e Sarcocystis spp. Após será feito PCR convencional para pesquisa de Trypanossoma spp., de acordo com Desquesnes (2001).
Extração de DNA:
Serão pesados 20 mg de tecido e adicionado 600 µL de solução de lise de núcleo e homogeneizado por 10 segundos e incuba-se em termobloco ou banho-maria a 65 °C por 15 a 30 minutos. Após, adiciona-se 3 µL de RNase e incuba a 55 °C por 14 a 16 horas.
Adiciona-se 200 µL de solução de precipitação de proteína, passa em vórtex e resfria no congelador por cinco minutos. Centrifuga-se a 16.000 g por quatro minutos, transfere-se o sobrenadante para um tubo contendo 600 µL de isopropanol a temperatura ambiente e homogeneíza por inversão. Centrifugação a 16.000 g por um minuto, remove-se o sobrenadante, adiciona-se 600 µL de etanol 70% em temperatura ambiente e mistura.
Centrifugação a 16.000 g por um minuto, aspira-se o etanol e deixa o pellet secar naturalmente mantendo o tubo aberto por 15 minutos. Então reidrata-se o DNA com 100 µL de solução de hidratação a 65 °C por uma hora.
Nested-PCR:
O mix da primeira reação é composto por 16,5 µL de água ultrapura + 2,5 µL de tampão –MgCl + 0,7 µL de dNTP + 1,25 µL de MgCl2 + 1 µL de primer Tg18S48F + 1 µL de primer Tg18S359R + 2 µL de DNA. O mix da segunda reação é composto por 16,5 µL de água ultrapura + 2,5 µL de tampão –MgCl2 + 0,7 µL de dNTP + 1,25 µL de MgCl2 + 1 µL de primer Tg18S58F + 1 µL de primer Tg18S348R + 2 µL de DNA.
A reação irá amplificar o RNA ribossomal 18S e terá como primers externos Tg18S48F (5’CCATGCATGTCTAAGTATAAGC3’) e Tg18S359R (5’GTTACCCGTCACTGCCAC3’) em sua primeira reação, e na segunda reação se utilizará os primers internos Tg18S58F (5’CTAAGTATAAGCTTTTATACGGC3’) e Tg18S348R (5’TGCCACGGTAGTCCAATAC3’). Tem-se um produto final de 290 pb para Sarcocystis neurona, Neospora caninum, Hammondia hammondi e Toxoplasma gondii e, para Sarcocystis spp., um produto com 310 pb. Como controle positivo se utilizará amostra de Neospora caninum cepa NC1, proveniente de cultivo celular. A reação se dá da seguinte forma: 94 °C por cinco minutos; 45 segundos a 94 °C, 45 segundos a 55 °C e 45 segundos a 72 °C (34x) e cinco minutos a 72 °C. Na eletroforese em gel de agarose utiliza-se um gel a 2% e então visualiza-se o resultado da reação em luz UV.
PCR convencional:
Como descrito por Desquesnes (2001), a reação irá utilizar os primers Kin1F (5’GCGTTCAAAGATTGGGCAAT3’) e Kin2R (5’CGCCCGAAAGTTCACC3’), que amplifica o gene ITS1, presente nas regiões conservadas entre rDNA 18S e 5.8S, com produtos que variam de 350 a 780 pb. Como controle positivo se utilizará amostra de Trypanossoma evansi sequenciada e utilizada como controle positivo no laboratório. A reação inicia com temperatura de 94 °C por três minutos e repete 34x a sequência de 60 segundos a 94 °C, 60 segundos a 53 °C, e 60 segundos a 72 °C, finalizando com cinco minutos a 72 °C. Na eletroforese em gel de agarose utiliza-se um gel a 1,5% e então visualiza-se o resultado da reação em luz UV.
Indicadores, Metas e Resultados
Obtenção de amostras de rins, fígados, tonsilas, baços, corações, pulmões, diafragmas e testículos de javalis.
Extração do DNA com pureza entre 1,8 2 2.0.
Realização do diagnóstico molecular para cada agente alvo.
Em função do generalista do javali, e do potencial zoonótico destes agentes, espera-se detectar, pelo menos, parte dos agentes pesquisados.
Extração do DNA com pureza entre 1,8 2 2.0.
Realização do diagnóstico molecular para cada agente alvo.
Em função do generalista do javali, e do potencial zoonótico destes agentes, espera-se detectar, pelo menos, parte dos agentes pesquisados.
Equipe do Projeto
| Nome | CH Semanal | Data inicial | Data final |
|---|---|---|---|
| BIBIANA RODRIGUES DE FREITAS | |||
| RODRIGO CASQUERO CUNHA | 1 |