Obtenção de amostras:
Amostras de órgãos de javali serão encaminhadas pelo Laboratório de Microbiologia e Imunologia Veterinária do Instituto Federal Farroupilha (LAMIVET – IFFAR), campus Frederico Westphalen, ao Laboratório de Doenças Parasitárias da Universidade Federal de Santa Maria (LADOPAR – UFSM) para diagnóstico. As amostras serão classificadas e identificadas de acordo com o sexo do animal – macho (M) e fêmea (F) – e com o órgão coletado.
As amostras de tecido serão recebidas já aliquotadas em microtubos de 2 mL, armazenadas em caixas de fibra de papel sob congelamento.
Todas serão submetidas à procedimento de extração de DNA com kit comercial Wizard® Genomic DNA Purification Kit - Promega®, com protocolo adaptado segundo Bräunig (2016).
Após a extração, serão realizadas reações de nested PCR para pesquisa de Toxoplasma gondii, Neospora caninum e Sarcocystis spp. Após será feito PCR convencional para pesquisa de Trypanossoma spp., de acordo com Desquesnes (2001).
Extração de DNA:
Serão pesados 20 mg de tecido e adicionado 600 µL de solução de lise de núcleo e homogeneizado por 10 segundos e incuba-se em termobloco ou banho-maria a 65 °C por 15 a 30 minutos. Após, adiciona-se 3 µL de RNase e incuba a 55 °C por 14 a 16 horas.
Adiciona-se 200 µL de solução de precipitação de proteína, passa em vórtex e resfria no congelador por cinco minutos. Centrifuga-se a 16.000 g por quatro minutos, transfere-se o sobrenadante para um tubo contendo 600 µL de isopropanol a temperatura ambiente e homogeneíza por inversão. Centrifugação a 16.000 g por um minuto, remove-se o sobrenadante, adiciona-se 600 µL de etanol 70% em temperatura ambiente e mistura.
Centrifugação a 16.000 g por um minuto, aspira-se o etanol e deixa o pellet secar naturalmente mantendo o tubo aberto por 15 minutos. Então reidrata-se o DNA com 100 µL de solução de hidratação a 65 °C por uma hora.
Nested-PCR:
O mix da primeira reação é composto por 16,5 µL de água ultrapura + 2,5 µL de tampão –MgCl + 0,7 µL de dNTP + 1,25 µL de MgCl2 + 1 µL de primer Tg18S48F + 1 µL de primer Tg18S359R + 2 µL de DNA. O mix da segunda reação é composto por 16,5 µL de água ultrapura + 2,5 µL de tampão –MgCl2 + 0,7 µL de dNTP + 1,25 µL de MgCl2 + 1 µL de primer Tg18S58F + 1 µL de primer Tg18S348R + 2 µL de DNA.
A reação irá amplificar o RNA ribossomal 18S e terá como primers externos Tg18S48F (5’CCATGCATGTCTAAGTATAAGC3’) e Tg18S359R (5’GTTACCCGTCACTGCCAC3’) em sua primeira reação, e na segunda reação se utilizará os primers internos Tg18S58F (5’CTAAGTATAAGCTTTTATACGGC3’) e Tg18S348R (5’TGCCACGGTAGTCCAATAC3’). Tem-se um produto final de 290 pb para Sarcocystis neurona, Neospora caninum, Hammondia hammondi e Toxoplasma gondii e, para Sarcocystis spp., um produto com 310 pb. Como controle positivo se utilizará amostra de Neospora caninum cepa NC1, proveniente de cultivo celular. A reação se dá da seguinte forma: 94 °C por cinco minutos; 45 segundos a 94 °C, 45 segundos a 55 °C e 45 segundos a 72 °C (34x) e cinco minutos a 72 °C. Na eletroforese em gel de agarose utiliza-se um gel a 2% e então visualiza-se o resultado da reação em luz UV.
PCR convencional:
Como descrito por Desquesnes (2001), a reação irá utilizar os primers Kin1F (5’GCGTTCAAAGATTGGGCAAT3’) e Kin2R (5’CGCCCGAAAGTTCACC3’), que amplifica o gene ITS1, presente nas regiões conservadas entre rDNA 18S e 5.8S, com produtos que variam de 350 a 780 pb. Como controle positivo se utilizará amostra de Trypanossoma evansi sequenciada e utilizada como controle positivo no laboratório. A reação inicia com temperatura de 94 °C por três minutos e repete 34x a sequência de 60 segundos a 94 °C, 60 segundos a 53 °C, e 60 segundos a 72 °C, finalizando com cinco minutos a 72 °C. Na eletroforese em gel de agarose utiliza-se um gel a 1,5% e então visualiza-se o resultado da reação em luz UV.