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A definição de probióticos, a qual refere-se a microrganismos vivos que, quando administrados em quantidades adequadas conferem benefícios à saúde do hospedeiro (HILL et al., 2014) está estabelecida há anos. Essa definição foi fundamentada principalmente na observação do efeito benéfico ao hospedeiro que determinados microrganismos exercem na prevenção e tratamento de condições patológicas (CZERUCKA; PICHE; RAMPAL, 2007). No entanto o conhecimento da influência exercida na fisiologia geral do organismo, como na modulação da homeostase imunológica, na ativação de mecanismos de imunidade de mucosa e na modulação de funções imunológicas adaptativas, confere a agregação do conceito de imunobióticos à definição desses microrganismos (CZERUCKA; PICHE; RAMPAL, 2007; SEN; MANSELL, 2020).
Bactérias de diversos gêneros, como Lactobacillus spp. e Bifidobacterium spp., compreendem a maior parte dos probióticos caracterizados até o momento, contudo a possibilidade de transmissão horizontal de genes de resistência a antibióticos entre bactérias probióticas e patogênicas torna a sua aplicação limitada (IMPERIAL; IBANA, 2016; ZHENG et al., 2017). Leveduras são naturalmente antibiótico-resistentes, porém não são capazes de transmitir essa resistência para outras leveduras ou bactérias pois os genes envolvidos estão presentes nos cromossomos, e não em plasmídeos bacterianos, como ocorre em genes de resistência para tetraciclina que podem ser compartilhados entre bactérias (AREVALO-VILLENA et al., 2017; CZERUCKA; PICHE; RAMPAL, 2007). Na microbiota normal do intestino, uma grande diversidade de leveduras pode ser identificada, onde as mais prevalentes são as do gênero Candida spp. e Saccharomyces spp, sendo possível identificar outras como Malasseziales spp., Hanseniaspora spp., Pichia spp., Debaryomyces spp., entre outras (NASH et al., 2017). Para colonizar o trato gastrointestinal (TGI), esses microrganismos precisam tolerar condições hostis, como pH estomacal (2.5-3.5), fluídos intestinais que contém suco pancreático e sais biliares e ainda temperaturas em torno de 37 °C (CZERUCKA; PICHE; RAMPAL, 2007).
Saccharomyces boulardii vem sendo comercializada e estudada desde os anos 1950, e atualmente é a levedura melhor caracterizada quanto sua atividade probiótica, segurança e aplicação no tratamento de doenças e condições crônicas gastrointestinais (SEN; MANSELL, 2020). Diferentes cepas de Saccharomyces cerevisiae também são estudadas quanto sua atividade probiótica de adesão celular, antagonismo a bactérias e imunomodulação (LARA-HIDALGO et al., 2017; TIAGO, F. C P et al., 2012). Contudo, outras leveduras não-Saccharomyces emergem como possíveis novos probióticos de ação benéfica igual ou superior às observadas para S. boulardii e S. cerevisiae (HATOUM; LABRIE; FLISS, 2012). O antagonismo a microrganismos patógenos, a produção de toxinas killer, a tolerância ao TGI e outras características que caracterizam microrganismos probióticos são observadas também em leveduras do gênero Candida spp., Hanseniospora spp., Pichia spp., Kluyveromyces spp., Torulospora spp., Issatchenkia spp., entre outras (FERNANDEZ-PACHECO RODRÍGUEZ et al., 2018; KURREY; ANU-APPAIAH; RAO, 2019; SHAMEKHI et al., 2020).
Estudos preliminares desenvolvidos pelo nosso grupo de pesquisa com leveduras selvagens isoladas do ambiente na região de Pelotas, no Rio Grande do Sul (dados não publicados), demonstram o potencial da atividade probiótica das leveduras Hanseniospora uvarum (PIT001), Pichia kluyveri (LAR001) e Candida intermedia (ORQ001), como também a capacidade de participar do processo fermentativo de bebidas. Essas leveduras são capazes de tolerar condições similares ao TGI in vitro, além de apresentar atividade antagonista a patógenos como Salmonella tiphymurium e Listeria monocytogenes. As três leveduras geralmente são associadas a sua presença no microbioma, perfil fermentativo e contribuição sensorial em produtos fermentados, como vinho, cerveja e cacau (BATISTA et al., 2015), além disso atualmente despertam o interesse na caracterização da sua atividade probiótica, principalmente no antagonismo a outras microrganismos (FERNÁNDEZ-PACHECO et al., 2019; FERNANDEZ-PACHECO RODRÍGUEZ et al., 2018; PEÑA et al., 2020; YOUNIS et al., 2017).
Candida intermedia demonstrou a capacidade de diminuir ou suprimir o crescimento de L. monocytogenes (GOERGES et al., 2006; HATOUM; LABRIE; FLISS, 2012), além de ser responsável pela produção de peptídeos antimicrobianos que afetam outras leveduras (PEÑA et al., 2020). Além de estar relacionada a produção de cervejas sem teor alcoólico (SAERENS; SWIEGERS, 2017), algumas cepas de P. kluyveri já tiveram seu potencial probiótico caracterizado in vitro (FAI et al., 2014; MENEZES et al., 2018), as quais geralmente apresentam a produção de peptídeos antimicrobianos capazes de inibir o crescimento de contaminantes em alimentos (LABBANI et al., 2015), produção de prebioticos a partir da conversão de carboidratos (FAI et al., 2014), antagonismo e competitividade por fontes de carbono com outros microrganismos (GROSS et al., 2018) e ainda a capacidade de crescimento em condições que simulam o TGI (TIAGO, Fabiana C.P. et al., 2009). Esses resultados corroboram com aqueles observados por nosso grupo de pesquisa em estudos com a cepa P. kluyveri LAR001. A levedura H. uvarum apresenta potencial na construção do perfil sensorial de diversos vinhos, e nos últimos anos, sua função como biocontrolador de fungos patogênicos e atividade probiótica também está sendo explorada (CASSANEGO et al., 2017; CORDERO-BUESO et al., 2017; YILDIRAN; BAŞYIĞIT KILIÇ; KARAHAN ÇAKMAKÇI, 2019). Diferentes espécies do gênero Hanseniaspora spp. apresentam características que as tornam potenciais cepas probióticas, como capacidade de auto- e co-agregação, produção de exopolissacarideos e atividade antagonista a patógenos como Candida albicans, Escherichia coli e Staphylococcus aureus (YILDIRAN; BAŞYIĞIT KILIÇ; KARAHAN ÇAKMAKÇI, 2019), ainda, Hanseniaspora spp. pode apresentar tolerância às condições hostis do TGI tanto quanto cepas de S. cerevisiae (FERNÁNDEZ-PACHECO et al., 2019).
Embora existam diversos estudos avaliando a atividade probiótica de cepas específicas dessas leveduras, ainda são poucas as informações quanto sua administração e comportamento in vivo, bem como o conhecimento das vias de localização e formas de atuação no TGI. Os mecanismos de ação do efeito imunomodulador ainda não são completamente elucidados, principalmente para leveduras não-Saccharomyces, contudo há evidências suficientes para uma investigação aprofundada (MACDONALD; BELL, 2010). Como avaliado para leveduras como Pichia pastoris (FRANÇA et al., 2015) e por nosso grupo para S. cerevisiae e S. boulardii (DE AVILA et al., 2016; PINTO et al., 2020; ROOS et al., 2018), a avaliação da imunomodulação do sistema imune e o controle a patógenos in vivo representam resultados importantes e expressivos na busca do potencial probiótico desses microrganismos. É possível observar a melhora na resposta imunológica a vacinas (ROOS et al., 2018), atividade imunoestimulatória específica (KOURELIS et al., 2010), redução na contagem de patógenos em animais infectados experimentalmente (PINTO et al., 2020) ou até mesmo a prevenção da infecção (DE AVILA et al., 2016; VEISSEIRE et al., 2020).
Recentemente, pesquisadores têm relacionado o efeito imunoestimulatório dos probióticos à potencialização da resposta imune a diferentes vacinas e antígenos, inclusive com grande relevância no tratamento e prevenção a infecção por SARS-CoV-2, vírus responsável pela pandemia Covid-19 (Coronavirus disease) (GOHIL et al., 2021; OLAIMAT et al., 2020; ZAFAR et al., 2020). Estudos prévios realizados por nosso grupo de pesquisa utilizando uma vacina experimental composta por SARS-CoV-2 e o adjuvante hidróxido de alumínio demonstraram que a vacina estimula resposta imune humoral e celular, a qual acredita-se que possa ser potencializada com a administração de probióticos.
Dessa forma, propomos avaliar o efeito imunomodulatório exercido pela suplementação oral em modelos animais com as leveduras P. kluyveri LAR001, H. uvarum PIT001 e C. intermedida ORQ0101, bem como avaliar a influência na resposta imune desses animais a uma vacina contra o vírus SARS-CoV-2. Sugere-se que o efeito imunomodulador dos probióticos será exercido à outras vacinas, especialmente àquelas baseadas em antígenos virais como SARS-CoV-2, potencializando a resposta imune ao antígeno. Ainda, propomos avaliar as alterações no microbioma e observar a localização das leveduras no trato gastrointestinal dos animais.

Produção dos probióticos
As leveduras P. kluyveri LAR001, H. uvarum PIT001 e C. intermedia ORQ001 fazem parte da coleção de microrganismos do Laboratório de Microbiologia do Centro de Desenvolvimento Tecnológico da UFPel, sendo assim, já estão preservados em glicerol sendo estocados a – 80 °C. As alíquotas referentes às leveduras serão descongeladas a temperatura ambiente e serão semeadas em meio YM (Yeast Mold Medium) agar para obtenção de colônias frescas e isoladas desses microrganismos. Uma colônia de cada microrganismo será selecionada para inoculação de 10 mL de meio YM líquido, onde serão propagadas durante 24 h, a 28 °C e agitação de 300 rpm. Passos sucessivos da cultura sob as condições anteriores serão realizados até a obtenção de 1 litro de cultivo contendo a concentração de células de aproximadamente 2x106 UFC/mL (Unidades Formadoras de Colônia). O mesmo protocolo de cultivo será utilizado para o probiótico S. boulardii (também disponível na coleção de microrganismos do Laboratório de Microbiologia), que será utilizado como controle durante a suplementação dos animais experimentais.

Animais
Para esse experimento serão utilizados 100 camundongos linhagem Balb/c disponibilizados pelo Biotério Central da Universidade Federal de Pelotas. Os animais serão separados em 10 grupos experimentais e alojados em gaiolas de polipropileno autoclaváveis, sem restrição de alimento ou água. O manuseio dos animais e os procedimentos experimentais serão realizados de acordo com a legislação brasileira (Lei N° 11.794 de 8 de outubro de 2008), seguindo as normas do Conselho Nacional de Controle e Experimentação Animal (CONCEA). Os animais receberão suplementação probiótica diretamente em sua alimentação, a qual será uma ração comercial isenta de quimioterápicos.


Vacinas
A vacina será composta pelo vírus SARS-CoV-2 inativado por formaldeído, na concentração de 1 1 × 106 UFP, adicionado de 10% de hidróxido de alumínio como adjuvante. Os animais serão inoculados, via subcutânea, duas vezes com intervalo de 21 dias entre as imunizações, com um volume de 100 µl.

Delineamento Experimental
Os animais serão divididos em 10 grupos experimentais contendo 10 animais em cada. A alimentação dos animais será suplementada com as leveduras P. kluyveri, H. uvarum, C. intermedia ou S. boulardii, dependendo do grupo designado. Os grupos determinados para os animais, a suplementação da alimentação e o respectivo protocolo de vacinação estão descritos na tabela 1. A suplementação será realizada durante 7 dias previamente a primeira vacinação, e será mantida durante todo o experimento, o qual irá durar 60 dias.

Tabela 1.
Grupo N° de animais Suplementação Vacina
A 10 S. boulardii SARS-CoV-2 inativado
B 10 P. kluyveri SARS-CoV-2 inativado
C 10 H. uvarum SARS-CoV-2 inativado
D 10 C. intermedia SARS-CoV-2 inativado
E 10 Sem suplementação SARS-CoV-2 inativado
F 10 S. boulardii Não vacinado
G 10 P. kluyveri Não vacinado
H 10 H. uvarum Não vacinado
I 10 C. intermedia Não vacinado
J 10 Sem suplementação Não vacinado


Coleta do material biológico
Serão coletadas amostras de sangue para a obtenção do soro a partir do dia 0 e a cada 7 dias colhidas da região submandibular (veias orbitais e veia submandibular). As amostras de sangue serão centrifugadas, o soro coletado, identificados individualmente e armazenados -20 °C até o momento das análises. Ao final do experimento, os animais serão submetidos a eutanásia pelo uso da anestesia inalatória com agente isofluorano e será realizado o procedimento de esplenectomia para avaliação da resposta celular, punção de macrófagos peritoneais, remoção cirúrgica dos linfonodos mesentéricos e inguinais, e intestino para análise histológica. Também serão realizadas coletas diárias das fezes dos animais para a realização do estudo de microbioma.

Avaliação da resposta imune humoral
Para realizar a pesquisa de anticorpos anti-SARS-CoV-2 nos soros dos camundongos será empregado o ensaio imunoenzimático indireto (ELISA), utilizando o vírus inativado como antígeno na concentração de 1 × 105 UFP e um conjugado com HRP de anticorpos IgG anti-mouse (Sigma-Aldrich, SP), ligados a peroxidase (Dako®), na diluição de 1:5000. Para avaliação das IgG1 e IgG2a será utilizado um kit de isotipagem (Sigma A 9044). Cada amostra de soro será examinada em triplicata para obtenção da absorbância média, sendo realizada a leitura em comprimento de ondas de 492nm.

Avaliação da resposta imune celular
Para avaliar o tempo mínimo do efeito do probiótico na imunidade celular dos animais, será utilizada a amplificação de fragmentos de genes de citocinas em cDNA obtido de mRNA, por método quantitativo (qPCR). A avaliação da imunidade celular será realizada a partir de um pool dos baços de 5 camundongos de cada grupo nos tempos de 24, 48, 72 e 144 horas após a vacinação de cada grupo. Serão removidos e macerados os baços, que terão suas células suspensas em solução balanceada de HANK’S (sem Ca e Mg). As células serão centrifugadas e o pellet suspenso em soluções de lise (cloreto de amônia a 0,8%), seguido de nova lavagem e suspensão em RPMI 1640 (Cultilab, Campinas, Brasil) com 10% de soro fetal bovino (SFB) (Cultilab, Campinas, Brasil), totalizando a concentração padrão de 2x106 cél/mL. Essas células serão plantadas em placas de 24 poços (Kasvi, Taiwan, China), 1 mL por poço e incubadas 24 horas a 37 °C em estufa com 5% de gás carbônico (CO2). Após 24 horas, o meio será renovado e as células estimuladas com o vírus SARS-CoV-2, 10 μg de concanavalina A (ConA, Sigma-Aldrich), com meio RPMI 1640 e incubadas por 18 horas sob as mesmas condições anteriores. Dado o tempo de incubação, o sobrenadante será descartado, as células coletadas com o reagente TRIzol® (Sigma-Aldrich) e armazenadas a -70 °C até o momento de extração do RNA. Será utilizado o método de extração por TRIzol, de acordo com as instruções do fabricante. A partir da quantificação do material obtido, será realizada a síntese de cDNA conforme as instruções do fabricante (Applied Biosystems). O método quantitativo de reação em cadeia da polimerase (qPCR) será realizado para a amplificação de segmentos dos genes correspondentes das citocinas e genes normalizadores. As reações de qPCR serão realizadas com 1 μL (~0.2 μg) de cDNA, 6,25 μL de SYBR Green (Invitrogen), 0,5μM de cada oligômero iniciador e 4,25 μL de água livre de RNase (Gibco-BRL), em um volume total de 12,5 μL. As temperaturas serão as seguintes: desnaturação a 95 °C por 5min, seguida de 40 ciclos com desnaturação a 95 °C por 30 s, anelamento a 60 °C por 60s e extensão a 72 °C por 60s e extensão final a 72 °C por 5 min. A partir dos valores de Threshold Cycle (Ct) obtidos será calculada a expressão relativa dos genes pela comparação com a expressão da β-actina, de acordo com o método 2-ΔΔCT descrito por Livak and Schmittgen (2001). Todas as amostras serão avaliadas em duplicata.

Análise do microbioma do TGI
Através da metagenômica será possível identificar as populações microbianas presentes no trato gastrointestinal dos animais e, caso haja, as alterações resultantes após o uso da suplementação na alimentação dos animais. Amostras de fezes serão coletadas antes da suplementação probiótica, no dia da primeira dose da vacinação, no dia da segunda dose da vacinação e ao final do experimento. Essas amostras serão armazenadas a -70 °C até o momento da extração de DNA. As amostras de DNA serão isoladas das fezes utilizando kit de extração (QiAmp DNA Stool Mini Kit), sendo posteriormente enviadas para a empresa ZymoResearch (Irvine, CA, EUA) para caracterização do microbioma. A identificação do metagenoma será realizada com 10% PhiX spike-in usando Sequenciamento de Nova Geração através do sistema Illumina® MiSeq™, com o kit de reagente v3 (600 ciclos). Inicialmente, serão construídas bibliotecas de DNA específicas para ambos os grupos. Para bactérias, haverá o sequenciamento do gene do RNA ribossomal 16S usando o kit Quick-16S™ NGS Library Prep Kit (ZymoResearch, Irvine, CA), no qual primers 16S serão utilizados para amplificar a região V3-V4 do gene. Na identificação dos fungos, será objetivada à amplificação completa da região ITS (Internal Transcribed Spacer) usando o mesmo kit, entretanto com a utilização de primers para ITS2. Controles negativos e positivos serão utilizados durante todos os processos.

Uso da Green Fluorescent Protein (GFP) recombinante para monitorar a localização das leveduras no TGI

As cepas de P. kluyveri, H. uvarum e C. intermedia serão transformadas geneticamente com plasmídeos desenvolvidos em nosso laboratório (processos protegidos por patentes N° de registro BR1020200151614 e BR1020200150324), que irão conferir a capacidade de expressão de GFP recombinante na superfície celular das leveduras, através da técnica de Yeast Surface Display. De forma breve, será realizada a subclonagem do gene da GFP no plasmídeo, o qual será inserido nas leveduras por eletroporação. A expressão da proteína recombinante será realizada a partir de processos bem estabelecidos em nosso laboratório, os quais baseiam-se no isolamento de clones recombinantes usando meios seletivos e indução da expressão do promotor GAL1 presente no cassete de expressão do plasmídeo.
Seguindo protocolos adaptados de CUI et al. (2020) e HAN et al. (2015), as leveduras serão administradas para camundongos pela via oral, em concentração de 1x1010 UFC/mL, sendo solubilizadas em 200 uL de solução salina estéril. Amostras do conteúdo luminal do estômago, jejuno, íleo e ceco serão pesadas, homogenizadas, diluídas em solução salina e cultivadas em meio Sc-U agar com galactose [2% agar, 2% galactose, 0.67% Yeast Nitrogen Base w/o amino acids and 0.19% Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplement (Sigma Aldrich)] para identificação das leveduras transformadas através da expressão de GFP.

O estudo proposto elucidará os mecanismos de imunomodulação de três leveduras não-Saccharomyces com potencial probiótico e fornecerá informações importantes para o estabelecimento dessas como microrganismos benéficos à saúde.
A obtenção dos perfis de resposta imune induzida pelas leveduras permitirá conhecer não só as características específicas de cada uma, como também elucidar a ação de probióticos de forma sistêmica no organismo. Essas informações são fundamentais principalmente para leveduras, as quais ainda representam um campo vasto e que necessita ser explorado.
Ao final desse projeto será possível comparar as características probióticas de P. kluyveri, H. uvarum e C. intermedia com os efeitos originados pelo uso de bactérias probióticas de ampla aceitação, como as do gênero Lactobacillus spp. e leveduras como S. boulardii e S. cerevisiae, podendo assim apresentar novos microrganismos que poderão ser distribuídos pela indústria como ferramentas para melhoria da saúde.
Os resultados que serão obtidos neste estudo além de gerar conhecimento acerca dos mecanismos de modulação da resposta imune por microrganismos probióticos, o que será válido para vacinas em geral, também poderão ser úteis na obtenção de uma vacina eficaz contra Covid-19, visto que poderá potencializar a resposta ao antígeno.
Os dados gerados nesses experimentos serão utilizados para publicação de dois artigos científicos em periódicos de alto fator de impacto e patentes que protejam o uso das cepas dessas leveduras, bem como os protocolos envolvidos nos experimentos.